胰岛素抵抗大鼠存活时间与Klotho表达关系的研究.pdf

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本声明的法律责任由本人承担论文作者签名：兰垃壮E t期：wfo 歹z 彳关于学位论文使用授权的声明本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：墓盔玉尹一导师签名：目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4符号说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9丑Ⅱ看⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯．．．．．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 1结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 5结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 0附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 1参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4 0综j 苤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 7致{ 谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 6攻读硕士期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 7A c k n o w l e d g e m e n t ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 6P u b l i c a t i o n s ⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．．⋯．．．．⋯⋯．．⋯．．⋯．．5 7山东大学硕士学位论文胰岛素抵抗大鼠存活时间与K J o t h o 表达关系的研究研究生冯复利导师李瑞峰教授中文摘要目的：通过链脲佐菌素( S T Z ) 诱导当日出生的W i s t a r 大鼠建立胰岛素抵抗( I R ) 模型，探讨胰岛素抵抗大鼠K l o t h o 的表达变化与存活时间的关系以及川芎嗪( T M P ) 与氨基胍( A G ) 治疗的干预作用。

方法：1 ．实验动物及分组：出生当H W i s t a r 大鼠，腹腔注射S T Z ( 9 0 m g ／k g ) 复制I R 模型( am o d e l o fn o n i n s u l i n - d e p e n d e n td i a b e t e si n d u c e db yn e o n a t a ls t r e p t o z o t o c i n ,n O ．S T Z ) 正常伺养至8 周龄，空腹血糖≥7 ．O m o l ／L 或糖耐量试验餐后l 小时血糖≥1 1 ．1 m o l ／L 者选入本研究设立正常对照组( C N 组) 、胰岛素抵抗组( I R组) 及川芎嗪+ 氨基胍( T M P + A G 组) 治疗组记录各组大鼠存活时间2 ．空腹血糖( F P G ) 、空腹胰岛素( F I N S ) 和糖化血清蛋白( G S P ) 检测：分别于造模第8 周、2 4 周和3 2 周断尾取空腹血，检测F P G ，留取血清检测F I N S 和G S P ，根据公式( F F ' G ·F I N S ) ／2 2 ．5 计算胰岛素抵抗指数( I R I ) 。

采用果糖胺法检测各组G S P含量3 ．生化指标检测：于造模3 2 周，摘眼球取血，离心留取血清，全自动生化分析仪测定血清中总胆固醇( T C ) 、甘油三酯( T G ) 、尿素氮( B U N ) 和肌酐( C r ) 留取肝、肾、脑等标本4 ．实时定量R T —P C R ：分别检测肾组织晚期糖基化终末产物受体( R A G E ) 、I G F 一1 R和k l o t h om R N A ，脑组织I G F - I R 和k l o t h om R N A ，肝组织I G F - I Rm R N A 的表达水平5 ．W e s t e r nB l o t ：检测肾和脑组织K l o t h o 蛋白、晚期糖基化终末产物受体( R A G E )及I G F 一1 R 表达，肝组织晚期糖基化终末产物受体( R A G E ) 及I G F 一1 R 的表达6 ．免疫组织化学染色：观察肾组织k l o t h o 蛋白、磷酸化的胰岛素样生长因子1受体( I G F - 1 R ) 蛋白表达结果：1 ．各组动物3 2 周龄存活率：I R 组为3 5 ％( 7 ／2 0 ) ，T M P + A G 组8 5 ％( 1 7 ／2 0 ) ，C N 组为山东大学硕士学位论文1 0 0 ％( 2 0 ／2 0 ) 。

I R 组存活率明显低于C N 组( P 10 9 6 的分离胶使用积层胶浓度4 ％3 0 ：0 ．8 ％w ／v 丙烯酰胺：双丙烯酰胺1 MT r i s - C 1p H 6 ．82 0 ％S D Sd H 2 0混合，灌胶前加入A P S 和T E M E D6 6 0U16 3 0u12 5U13 ．6m l1 8山东大学硕士学位论文1 0 ％A P S2 5plT E M E D5l I1总体积5 m l使用W h a t m a n3 m m 滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制积层胶用1 0 m l注射器将积层胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡凝胶聚合l d , 时左右③样品准备：上样染液( L a e m m l i 上样染液)3 X 储存液1 M T d s - C 1 p H 6 ．82 ．4 m l2 0 ％S D S3 皿甘油( 1 0 0 呦3m lB 巯基乙醇1 ．6m l 溴酚蓝0．0069总体积1 0m l ( 储存于4 C )准备l X 上样缓冲液的样品液：如6 | Il 蛋白样品加入3I Il3 ×上样染液储存液每孔配制含5 0 u g 总蛋白样的样品液。

上样前煮沸5 分钟④加入电泳缓冲液，上样：凝胶电泳前，拔去梳子，每孔均用1 ×电泳缓冲液清洗上、下层电泳槽中加入1 ×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1 到2 c m B i o R a d电泳槽中需加入5 0 0m l 的lX 电泳缓冲液( 5 0m l 的1 0 X 储存液+ 4 5 0m ld H 2 0 ) 将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中⑤电泳：使用B i o R a d 电泳装置，样品首先在2 0m A 恒定电流下电泳至染料接近分离胶顶端然后6 0 m A 恒定电流电泳至溴酚蓝刚出胶底部2 ) 蛋白质转移：准备好B i o ．R a d 蛋白转移装置夹板，凝胶用l ×转移缓冲液稍微清洗：吸水纸，滤纸( 比凝胶稍微大一些) 用lX 转移缓冲液预湿，如下顺序装配于转移装置上：吸水纸一滤纸一凝胶一P V D F 膜一滤纸一吸水纸，3 0 0 m A 恒流条件下，1 小时3 ) 封阻：转移后的硝酸纤维素膜在5 ％封闭液中室温封阻1 l l ，然后用T B S ．T 缓冲1 9山东大学硕士学位论文液充分洗膜，清洗方法：快速漂洗X2 次，1 5 r n i n X1 次，5 r a i n X3 次。

4 ) 与第一抗体孵育：将膜与羊抗人R A G E 多克隆抗体室温下共同孵育1 1 l ，其中抗体用T B S ．T 缓冲液按l ：1 0 0 0 稀释，孵育完毕用T B S ．T 缓冲液充分洗膜，洗涤方法同上5 ) 与第二抗体孵育：将膜与辣根过氧化物酶标记的驴抗羊第二抗体室温下孵育l h ( T B S ．T 缓冲液按1 ：1 0 0 0 稀释抗体) ，然后用T B S ．T 缓冲液充分洗膜，方法：快速漂洗×3 次，1 5 r n i n X 2 次，5 r a i n ×3 次6 ) 显影：E C L 化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液将膜置于反应液中室温孵育5 分钟倾斜硝酸纤维膜，用滤纸沿其边缘尽量吸干显色液，并用保鲜膜将膜包好( 尽量平整避免气泡) ，在暗室中迅速将膜蛋白面贴在X 光胶片上曝光，首次1 5 秒，然后在洗片机中显影，洗像，调整曝光时间，重复上步操作，直至显影出最佳电泳带7 ) 图片扫描保存，试验重复3 次1 ．2 ．1 1 免疫组织化学染色K l o t h o 免疫组化步骤：( 1 ) 取石蜡切片常规脱蜡至水；( 2 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 3 ) 3 ％H ：0 2 室温1 0 分钟；( 4 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 5 ) 微波抗原修复9 2 ℃- - 9 8 ℃持续1 0 一1 5 分钟；( 6 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 7 ) 5 ％山羊血清封闭，室温2 0 分钟：( 8 ) 倾去血清，滴加抗体K l o t h o ( 1 ：1 0 0 ) ，4 “ C 孵育过夜；( 9 ) 室温复温1 5 分钟；( 1 0 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 1 1 ) 滴加辣根过氧化酶标记的兔抗山羊二抗( 1 ：2 0 0 ) ，室温孵育l d ' 时；( 1 2 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 1 3 ) D A B 显色；( 1 4 ) 自来水冲洗；山东大学硕士学位论文( 1 5 ) 苏木素复染2 分钟；( 1 6 ) 1 ％盐酸酒精分化5 秒；( 1 7 ) 流水冲洗5 —1 0 分钟；( 1 8 ) 7 0 9 6 乙醇3 0 秒；( 1 9 ) 8 0 ％乙醇1 分钟；( 2 0 ) 9 0 ％乙醇2 分钟；( 2 1 ) 9 5 ％乙醇2 分钟；( 2 2 ) 1 0 0 ％乙醇1 3 分钟；( 2 3 ) 1 0 0 ％乙醇I I5 分钟；( 2 4 ) 二甲苯1 5 分钟；( 2 5 ) 二甲苯I I5 ／' - 钟；( 2 6 ) 中性树胶封片。

阴性对照应用P B S 代替一抗I G F - 1 R 免疫组化步骤；( 1 ) 取石蜡切片常规脱蜡至水；( 2 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 3 ) 3 ％H 2 0 室温1 0 分钟；( 4 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 5 ) 微波抗原修复9 2 ℃一9 8 ℃持续1 0 - - 1 5 分钟；( 6 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 7 ) 5 ％山羊血清封闭，室温2 0 分钟：( 8 ) 倾去血清，滴加抗体P I G F - 1 R ( 1 ：1 0 0 ) ，4 “ C 孵育过夜；( 9 ) 室温复温1 5 分钟；( 1 0 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 1 1 ) 滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗( 1 ：2 0 0 ) ，室温孵育l d ' 时；( 1 2 ) P B S 冲洗5 分钟，反复三次；( 1 3 ) D A B 显色；( 1 4 ) 自来水冲洗：( 1 5 ) 苏木素复染2 分钟；2 1山东大学硕士学位论文( 1 6 ) 1 ％盐酸酒精分化5 秒；( 1 7 ) 流水冲洗5 —1 0 分钟；( 1 8 ) 7 0 ％乙醇3 0 秒；( 1 9 ) 8 0 ％乙醇1 分钟；( 2 0 ) 9 0 9 6 乙醇2 分钟：( 2 1 ) 9 5 ％乙醇2 分钟；( 2 2 ) 1 0 0 ％乙醇1 3 分钟；( 2 3 ) 1 0 0 ％乙醇I I5 分钟；( 2 4 ) 二甲苯1 5 分钟；( 2 5 ) 二甲苯1 1 5 分钟；( 2 6 ) 中性树胶封片。

阴性对照应用P B S 代替一抗1 ．3 数据分析与统计所有实验数据均采用x 。