注射用重组人促红素EPO.doc

注射用重组人促红素注射用重组人促红素 EPO（（CHO 细胞）细胞）3 检定检定3.13.1 原液检定原液检定 3.1.13.1.1 蛋白质含量蛋白质含量用 4g/L 碳酸氢铵溶液 将供试品稀释至 0.5-2mg/ml，作为供试品溶液以 4g/L 碳酸氢铵溶液作为空白测定供试品溶液在 320nm，325nm，330nm，335nm ,340nm，345nm 和 350nm 的吸光度用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数做 直线回归，求得回归方程照紫外-可见分光光度法（附录 II A），在波长 276nm～280nm 处，测定供试品溶液最大吸光度 Amax，将 Amax 对应波长带入回归方 程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度 A 光散射按下式计算，应不低于 0.5 mg/ml 蛋白质含量（mg/ml）=（Amax-A 光散射）÷7.43×供试品稀释倍数×10 3.1.23.1.2 生物学活性生物学活性 3.1.2.13.1.2.1 体内法体内法 依法测定（附录Ⅹ B） 3.1.2.23.1.2.2 体外法体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定 3.1.33.1.3 体内比活性体内比活性 每 1mg 蛋白质应不低于 1.0×105IU。

3.1.43.1.4 纯度纯度3.1.4.13.1.4.1 电泳法电泳法 依法测定（附录Ⅳ C）用非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝 染色，分离胶胶浓度为 12.5%，加样量应不低于 10μg，经扫描仪扫描，纯度应不 低于 98.0% 3.1.4.2 高效液相色谱法高效液相色谱法 依法测定（附录Ⅲ B）亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限 300kD，孔径 24nm,粒度 10μm，直径 7.5mm,长 30cm；流动相为 3.2mmol/L 磷酸氢二钠- 1.5mmol/L 磷酸二氢钾-400.4mmol/L 氯化钠，pH7.3；上样量 20～100μg，于波长 280nm 处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于 1500按面积归一化法 计算人促红素纯度，应不低于 98.0% 3.1.5 分子量分子量 依法测定（附录Ⅳ C）用还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝 R250 染色，分离胶胶浓度为 12.5%，加样量应不低于 1μg，分子质量应为 36～45kD3.1.6 紫外光谱扫描紫外光谱扫描 依法测定（附录Ⅱ A），用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至 0.5-2mg/ml, 在光路 1cm、波长 230nm-360nm 下进行扫描，其最大吸收峰 279nm±2nm；最小 吸收峰 250nm±2nm；在 320～360nm 处无吸收峰。

3.1.7 等电聚焦等电聚焦 取尿素 9g、30%丙烯酰胺单体溶液 6.0ml、40% pH 3-5 的两性电解质溶液 1.05ml、40% pH 3-10 的两性电解质溶液 0.45 ml、水 13.5ml，充分混匀后，加入 N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺 15μl 和 10%过硫酸铵溶液 0.3ml，脱气后制成 凝胶，加供试品溶液 20μl（浓度应在每 1 ml 含 0.5 mg 以上），照等电聚焦电泳 法进行（附录Ⅳ D），同时做对照电泳图谱应与对照品一致 3.1.8 唾液酸含量唾液酸含量 每 1mol 人促红素应不低于 10.0mol (附录Ⅵ C) 3.1.9 外源性外源性 DNA 残留量残留量 每 10000IU 人促红素应不高于 100pg（附录Ⅸ B） 3.1.10 CHO 细胞蛋白残留量细胞蛋白残留量 用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于蛋白质总量的 0.05% 3.1.11 细菌内毒素检查细菌内毒素检查 每 10000IU 人促红素应小于 2EU（附录 Ⅻ E 凝胶限量试验） 3.1.12 牛血清白蛋白残留量牛血清白蛋白残留量 依法测定（附录Ⅷ 1），应不高于 0.01%。

3.1.13 肽图（至少每年测定肽图（至少每年测定 1 次）次） 供试品经透析、冻干后, 用 1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至 1.5mg/ml，依法测 定（附录Ⅷ E），其中加入胰蛋白酶（序列分析纯），37℃±0.5℃保温 6 小时， 色谱柱为反相 C8柱(25cm×4.6mm，粒度 5μm，孔径 30nm) ，柱温为 45℃±0.5℃；流速为 0.75ml/分钟；进样量为 20μl；按下表进行梯度洗脱（表中 A 为 0.1%三氟乙酸水溶液，B 为 0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液） 编号时间/分钟流速/ml A% B% 10. 00 0.75100.0 0.0 230.00 0.7585.0 15.0 375.000.7565.0 35.0 4115.000.7515.0 85.0 5120.000.750.0 100.0 6125.000.75100.0 0.0 7145.000.75100.0 0.0肽图应与人促红素对照品一致 3.1.14 N-末端氨基酸序列（至少每年测定末端氨基酸序列（至少每年测定 1 次）次） 用氨基酸序列分析仪测定。

N-末端序列应为：Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr 3.2 半成品检定半成品检定 3.2.1 细菌内毒素检查细菌内毒素检查 依法测定,每 1000IU 人促红素应小于 2EU（附录Ⅻ E 凝胶限量试验） 3.2.2 无菌检查无菌检查 依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定 3.3 成品检定成品检定 除复溶时间、水分测定、和装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水， 复溶后进行其余各项检定 3.3.1 鉴别试验鉴别试验 按免疫印迹法（附录Ⅷ A）或免疫斑点法（附录Ⅷ B）测定，应为阳性 3.3.2 物理检查物理检查 3.3.2.1 外观与复溶时间外观与复溶时间 应为白色疏松体，复溶后应为无色澄明液体，加入标示量的灭菌注射用水，复 溶时间应该不超过两分钟 3.3.2.2 可见异物可见异物 依法检查（附录Ⅴ B），应符合规定 3.3.2.3 装量装量 依法检查（附录Ⅰ A），应符合规定 3.3.3 化学检定化学检定 3.3.3.1 pH 值值 依法测定（附录 V A），应符合批准的要求 3.3.3.2 钠离子含量钠离子含量 应不大于 190mmol/L（附录Ⅶ J）。

3.3.3.3 水分水分 应不高于 3.0%（附录Ⅶ D） 3.3.3.4 人血白蛋白质含量人血白蛋白质含量 依法测定（附录Ⅵ B 第二法），应符合经批准的蛋白质含量范围 3.3.3.5 渗透压摩尔浓度渗透压摩尔浓度 依法测定（附录 V H），应符合批准的要求 3.3.4 生物学活性生物学活性 3.3.4.1 体外法体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定，应为标示量的 80%～120% 3.3.4.2 体内法体内法 依法检查（附录Ⅹ B）应为标示量的 80%～140% 3.3.5 无菌检查无菌检查 依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定 3.3.6 细菌内毒素检查细菌内毒素检查每 1000IU 人促红素应小于 2EU； 5000IU/支以上规格的人促红素，每支应小 于 10EU（附录Ⅻ E 凝胶限量试验） 3.3.7 异常毒性检查异常毒性检查 依法检查（附录Ⅻ F 小鼠试验法），应符合规定。