实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌【青苗教育】.ppt

实验三实验三重组质粒重组质粒DNA转化大肠杆菌转化大肠杆菌‹#›技能教育实实 验验 目目 的的 p 学习将重组质粒学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法导入大肠杆菌的方法p 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法p 为下一步重组体筛选做准备为下一步重组体筛选做准备‹#›技能教育实实 验验 原原 理理 遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表型性状分子克隆中用人工的方法将重组质粒表型性状分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大导入大肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，这个过程就是转化这个过程就是转化 将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源种短暂的感受态以摄取外源DNA大肠杆菌细胞经过一些特。

大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（电击法、殊方法（电击法、 CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进分子进入的细胞即感受态细胞入的细胞即感受态细胞(Competent cells)‹#›技能教育 转化转化(Transformation) 是将外源是将外源DNA分子引入受体分子引入受体细胞，使之胞，使之获得新的得新的遗传性状的性状的一种手段，它是微生物一种手段，它是微生物遗传、分子、分子遗传、基因工程等研究、基因工程等研究领域的域的基本基本实验技技术 0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在是一种低渗溶液，在0℃低温低温处理大理大肠杆菌杆菌细胞胞时，，细胞膨胞膨胀成球形，成球形，DNA可吸附在其表面在短可吸附在其表面在短暂的的热冲冲击（如（如42 ℃ ）下，）下，细胞可吸收外源胞可吸收外源DNA 为了了鉴定定这些些转化子，化子，须利用利用质粒粒编码的的筛选标记，，这些些标记赋予予细菌新的表型，是成功菌新的表型，是成功转化的化的细菌很容易被菌很容易被筛选出来。

出来pET32a质粒粒带有氨有氨苄西林抗性基因（西林抗性基因（Ampr），其重），其重组体体转化的化的大大肠杆菌能杆菌能够在含氨在含氨苄西林的培养基上生西林的培养基上生长，而未，而未转化的受体菌化的受体菌则不能再不能再这种培养基上生种培养基上生长‹#›技能教育Ampr：氨苄西林抗性基因：氨苄西林抗性基因 – β内酰胺酶内酰胺酶多克隆位点（多克隆位点（MCS）：外源）：外源DNA片段的插入位点片段的插入位点Amps菌株菌株Ampr涂布于含涂布于含Amp的培养基上，可以生长的培养基上，可以生长次日可见白色菌落次日可见白色菌落-- 转化子培养基上含有培养基上含有X-Gal和和IPTG时，可使用蓝白时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子的重组的转化子pET32apET32a‹#›技能教育结构的三大要素：结构的三大要素：• 多克隆位点• 选择标记（耐药性，LacZ）• 复制起始位点种类：种类：• 质粒• 噬菌体• 酵母人工染色体（YAC）• 反转录病毒载体• 表达载体等‹#›技能教育‹#›技能教育pET-32a VectorThe pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli. ‹#›技能教育pET-32 cloning/expression region‹#›技能教育Vector (pET-32a)Gene fragment (SmPR10)pET32a-SmPR10‹#›技能教育材料、设备及试剂材料、设备及试剂 材料材料Ø E. coli DH5α菌株菌株: R-、、M-、、Amp- (转化过程所用的受体细胞转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳分子进入体内并稳定地遗传给后代。

定地遗传给后代Ø pET32a-SmPR10质粒质粒DNA（浓度：（浓度：2 ng/μl): 实验室自制实验室自制设备设备Ø 恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪 ‹#›技能教育 试剂试剂 1、、LB固体和液体培养基固体和液体培养基 LB培养基配方：（单位培养基配方：（单位g/L）） 胰蛋白胨胰蛋白胨 10 酵母提取物酵母提取物 5 NaCl 10 琼脂粉（琼脂粉（1.5%）） 15g （注：（注：LB液体培养基不加琼脂粉）液体培养基不加琼脂粉） 按配方称量药品按配方称量药品,加入一定量的加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至定容至1000ml,用用NaOH调节调节pH至至7.0。

121℃℃湿热高压灭菌湿热高压灭菌20分钟，待冷却至分钟，待冷却至60℃℃左右左右,在超净工作台中加在超净工作台中加入一定量的入一定量的Amp储存液储存液,使终浓度为使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板摇匀后用培养皿铺板‹#›技能教育2、、Amp母液：母液： 称取氨苄西林称取氨苄西林100mg溶于溶于1mlddH2O中，中，0.22μm滤器滤器过过滤除菌滤除菌，用，用1.5ml离心管分装后储存于离心管分装后储存于-20℃℃冰箱冰箱. 3、、0.1mol/L CaCl2 溶液溶液: 称称0.56gCaCl2(无水分析纯无水分析纯),溶于溶于50ml重蒸水中重蒸水中,定容至定容至100ml,用用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌滤器过滤除菌或高压灭菌EP管分装于管分装于4℃℃冰箱储存冰箱储存 .4、、 pET32a-SmPR10质粒：实验室自制质粒：实验室自制‹#›技能教育操操 作作 步步 骤骤（一）（一） 受体菌的培养受体菌的培养 1、取、取-70℃℃或或-20℃℃贮存的大肠杆菌贮存的大肠杆菌DH5α菌种，菌种，在在LB培养液中培养过夜，培养液中培养过夜，进行活化进行活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布平板上涂布,于于37℃℃培养箱中培养培养箱中培养24h；从；从LB平板上挑取单菌落平板上挑取单菌落,接种于接种于3-5ml LB液液体培养基中体培养基中,37℃℃下振荡培养下振荡培养12小时左右小时左右,直至对数生长后期。

直至对数生长后期3、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于的比例接种于LB液体培养基中液体培养基中,37℃℃振荡培振荡培养养2-3小时至小时至OD600 ＝＝0.5左右左右(生长对数期）生长对数期）注：这一步非常关键注：这一步非常关键培养过度的菌液含有较多的培养过度的菌液含有较多的“老老”细胞，制备成感受态细胞后其接受细胞，制备成感受态细胞后其接受外援外援DNA能力较低，从而导致转化率降低能力较低，从而导致转化率降低 ‹#›技能教育（二）、（二）、 感受态细胞的制备感受态细胞的制备 ( CaCl2 法法) ) 1、将菌液、将菌液转入入1.5ml离心管中离心管中,冰上冰上放置放置10分分钟,然后于然后于4℃、、4000rpm离心离心10分分钟　2、弃去上清、弃去上清,用用预冷冷的的0. 1mol/L的的CaCl2 溶液溶液1ml轻轻悬浮浮细胞胞,冰上放置冰上放置10分分钟后后,4℃、、4000rpm离心离心10分分钟 3、弃去上清、弃去上清,加入加入0.1ml预冷冷的的0. 1mol/L的的CaCl2 溶液溶液,轻轻悬浮浮细胞每份100μl（注意（注意悬液密度要均匀）液密度要均匀）,冰冰上放置上放置备用。

　用　4、、暂时不用的感受不用的感受态细胞可置于胞可置于 -80℃保存注：注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！‹#›技能教育（三）（三） 重组质粒重组质粒DNADNA的转化的转化 1.质粒和感受粒和感受态细胞混和：在胞混和：在100μl感受感受态细胞胞悬液中加液中加入入5μl重重组质粒粒DNA（（ pET32a-SmPR10 ），），轻轻混匀混匀后冰上放置后冰上放置30分分钟 2.热击：：42℃水浴中水浴中热击60秒（秒（注：精确注：精确计算算时间，，热击过长将将对细胞造成胞造成伤害害））,热击后后马上置于冰上冷上置于冰上冷2-5分分钟 3.复复苏：向每管中加入：向每管中加入800μl LB液体培养基液体培养基(注：不含注：不含Amp),混匀后在混匀后在37℃150rpm轻摇培养培养1小小时，，使使细菌恢菌恢复正常生复正常生长状状态，并表达，并表达质粒粒编码的抗生素抗性基因的抗生素抗性基因(Ampr )思考：思考：热击后的细胞已吸入外源质粒，如本实验中的热击后的细胞已吸入外源质粒，如本实验中的pET32a，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。

但是为，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性但是为什么复苏时用的什么复苏时用的LB培养液不加培养液不加Amp？？‹#›技能教育（四）涂布平板筛选转化质粒（四）涂布平板筛选转化质粒 1. 将管中培养液摇匀后取将管中培养液摇匀后取100μl 均匀涂布于含均匀涂布于含Amp的筛选的筛选平板上 （注：将培养液摇匀后涂布注：将培养液摇匀后涂布2. 正面向上放置半小时正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后待菌液完全被培养基吸收后倒置倒置培培养皿养皿，，37℃℃温箱中培养过夜温箱中培养过夜，次日观察实验结果，次日观察实验结果‹#›技能教育预期实验结果预期实验结果感受态细胞感受态细胞+重组质粒重组质粒0.1MCaCl2+重组质粒重组质粒感受态细胞感受态细胞+无菌水无菌水‹#›技能教育实验报告 思考题思考题 (1). 根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？(2). 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？你将如何解释这种现象？ ‹#›技能教育实验中要考虑的重要因素实验中要考虑的重要因素 为了提高转化效率为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度: 不要用经过多次继代或储于４不要用经过多次继代或储于４℃℃的培的培养菌，最好从养菌，最好从-70℃℃或或-20℃℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，感受态细胞的菌液细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的可通过监测培养液的OD600 来控制DH5α菌株的菌株的OD600 为为0.5时时,细胞密度在细胞密度在5×107 个个/ml左右左右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同),这时比这时比较合适密度过高或不足均会影响转化效率密度过高或不足均会影响转化效率 ‹#›技能教育 2. 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)转化效率与外源转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比的浓度在一定范围内成正比,但但当加入的外源当加入的外源DNA的量过多或体积过大时的量过多或体积过大时,转化效率就会降低转化效率就会降低10ng的的cccDNA即可使即可使100μl 的感受态细胞达到饱和一般情况下的感受态细胞达到饱和一般情况下,DNA溶溶液的体积不应超过感受态细胞体积的液的体积不应超过感受态细胞体积的5％ 3. 试剂的质量试剂的质量: 所用的试剂，如所用的试剂，如CaCl2 等均需是高纯度的等均需是高纯度的(GR.或或AR.),并并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

4. 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件严格来说，整个操作过程均应在无菌条件下进行下进行, 所用器皿所用器皿, 如离心管如离心管, tip头等最好是新的头等最好是新的,并经高压灭菌处理并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂酶或杂DNA所污所污染染, 否则均会影响转化效率或杂否则均会影响转化效率或杂DNA的转入的转入, 为以后的筛选、鉴定带来为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦不必要的麻烦 ‹#›技能教育。