中药指纹图谱的研究与实践.ppt

中药指纹图谱的研究与实践中药指纹图谱的研究与实践屠鹏飞屠鹏飞（北京大学中医药现代研究中心，（北京大学中医药现代研究中心，北京北京100083））第一部分第一部分 概述概述一、建立中药指纹图谱质量标准的必要性一、建立中药指纹图谱质量标准的必要性•质量稳定的原料是生产质量稳定的产品的先决条件质量稳定的原料是生产质量稳定的产品的先决条件•中药材绝大部分来源于生物，其活性成分大部分为生中药材绝大部分来源于生物，其活性成分大部分为生物体内次生代谢产物，少数为初生代谢产物物体内次生代谢产物，少数为初生代谢产物•产地、气候、生态环境、栽培或养殖技术、产地加工、产地、气候、生态环境、栽培或养殖技术、产地加工、炮制方法等对中药材的化学成分影响很大炮制方法等对中药材的化学成分影响很大•大部分中药的有效成分未被阐明或仅部分阐明大部分中药的有效成分未被阐明或仅部分阐明•单一指标的定性、定量分析，不能有效地控制中药材单一指标的定性、定量分析，不能有效地控制中药材或中成药的质量或中成药的质量•确保中药的生物等效性确保中药的生物等效性二、中药化学指纹图谱的定义与特点二、中药化学指纹图谱的定义与特点•定义：定义：中药化学指纹图谱系指中药材或中成药中药化学指纹图谱系指中药材或中成药经适当处理后经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药主要化学成分特性的色谱或光能够标示该中药主要化学成分特性的色谱或光谱的图谱。

谱的图谱•特点：特点： （（1）通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样）通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地；品的真伪或产地； （（2）通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例）通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保样品质的制定，能有效控制样品的质量，确保样品质量的相对一致量的相对一致三、中药指纹图谱的作用三、中药指纹图谱的作用•作为药品的质量标准组成部分作为药品的质量标准组成部分•企业产品质量的内控标准企业产品质量的内控标准•企业药品生产的过程控制企业药品生产的过程控制•企业产品创优或打假企业产品创优或打假第二部分第二部分 中药材指纹图谱的建立中药材指纹图谱的建立•品种品种•药用部位药用部位•产地产地•栽培技术栽培技术•产地加工方法产地加工方法•炮制炮制•供试品的制备方法供试品的制备方法•测定方法、条件的考察测定方法、条件的考察•方法学考察：稳定性、精密度、重现性方法学考察：稳定性、精密度、重现性•对照指纹图谱的建立对照指纹图谱的建立中药材指纹图谱的定义：中药材指纹图谱的定义： 中中药药材材指指纹纹图图谱谱系系指指中中药药材材经经适适当当处处理理后后，，采采用用一一定定的的分分析析手手段段，，得得到到的的能能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。

够标示该中药材特性的共有峰的图谱 如如果果原原药药材材需需经经过过特特殊殊炮炮制制（（如如醋醋制制、、酒酒制制、、炒炒炭炭等等）），，则则应应制制定定原原药药材材和炮制品指纹图谱的检测标准和炮制品指纹图谱的检测标准一、指纹图谱的检测标准一、指纹图谱的检测标准内容：内容： 名称、汉语拼音、拉丁名、名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数检测方法、指纹图谱及技术参数1、名称、名称中文名、汉语拼音中文名、汉语拼音2、来源、来源•原原植植、、动动物物：：科科名名、、中中文文名名、、拉拉丁丁学学名名、、药药用用部部位位、、产产地地、、 采采收收季季节节、、产产地地加加工工、、炮制方法等炮制方法等•矿矿物物药药：：矿矿物物的的类类、、族族、、矿矿石石名名或或岩岩石石名名、、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等主要成分、产地、产地加工、炮制方法等来源•动、植物药材：动、植物药材：应固定品种、药用部位、应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法产地、采收期、产地加工和炮制方法•矿物药：矿物药：固定产地和炮制、加工方法。

固定产地和炮制、加工方法•供试品的取样：供试品的取样：保证供试品的代表性和均保证供试品的代表性和均一性3、供试品的制备•应应根根据据中中药药材材中中所所含含化化学学成成分分的的理理化化性性质质和和检检测测方方法法的的需需要要，，选选择择适适宜宜的的方方法法进行制备进行制备•制制备备方方法法必必须须确确保保该该中中药药材材的的主主要要化化学学成分在指纹图谱中的体现成分在指纹图谱中的体现•对对于于注注射射剂剂用用中中药药材材，，可可按按注注射射剂剂制制备备工艺制备供试品，制定指纹图谱工艺制备供试品，制定指纹图谱4、参照物的制备•制定指纹图谱必须设立参照物制定指纹图谱必须设立参照物•应应根根据据供供试试品品中中所所含含成成分分的的性性质质，，选选择择适适宜宜的的对对照照品品作作为为参参照照物物，，如如果果没没有有适适宜宜的的对对照照品品，，可可选选择择适适宜宜的的内内标标物物作作为为参照物•参参照照物物的的制制备备应应根根据据检检测测方方法法的的需需要要，，选择适宜的方法进行制备选择适宜的方法进行制备5、测定方法●包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。

●应应根根据据中中药药材材所所含含化化学学成成分分的的理理化化性性质质，，选选择择适适宜的测定方法，宜的测定方法，建议优先考虑色谱方法建议优先考虑色谱方法●对对于于成成分分复复杂杂的的中中药药材材，，必必要要时时可可以以考考虑虑采采用用多多种测定方法，种测定方法，建立多张指纹图谱建立多张指纹图谱●以以色色谱谱方方法法制制定定指指纹纹图图谱谱所所采采用用的的色色谱谱柱柱、、薄薄层层板板、、试试剂剂、、测测定定条条件件等等必必须须固固定定；；以以光光谱谱方方法法制制定指纹图谱，相应条件也必须固定定指纹图谱，相应条件也必须固定6 6、、指纹图谱及技术参数指纹图谱及技术参数(1)指纹图谱●根据供试品的检测结果，建立指纹图谱根据供试品的检测结果，建立指纹图谱●采采用用HPLC和和GC制制定定指指纹纹图图谱谱，，其其记记录录时时间间根根据据样样品品所所含含成成分分的的情情况况而而定定，，一一般般为为1小小时时；；采采用用TLCS制制定定指指纹纹图图谱谱，，必必须须提提供供从从原原点点至至溶溶剂剂前前沿沿的的图图谱谱；；采采用用光光谱谱法法制制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供全谱提供全谱。

●化学成分类型复杂的品种，必要时可建立化学成分类型复杂的品种，必要时可建立多张指纹图谱多张指纹图谱●指指纹纹图图谱谱的的建建立立：：根根据据10批批次次以以上上供供试试品品的的检检测测结结果果所所给给出的相关参数，制定指纹图谱出的相关参数，制定指纹图谱(2)共有指纹峰的标定•采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，参照物的保留时间，计算指纹峰的相对计算指纹峰的相对保留时间保留时间•根据根据10批次以上供试品的检测结果，标批次以上供试品的检测结果，标定中药材的定中药材的共有指纹峰共有指纹峰•色谱法采用色谱法采用相对保留时间相对保留时间标定指纹峰，标定指纹峰，光谱法采用光谱法采用波长或波数波长或波数标定指纹峰标定指纹峰(3)指纹图谱的评价指纹图谱的评价•以指纹图谱相似度评价软件进行评价以指纹图谱相似度评价软件进行评价•以相对保留时间和峰面积比值进行评价以相对保留时间和峰面积比值进行评价共有指纹峰面积的比值•以以对照品对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；物峰面积的比值；•以以内标物内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（指纹峰中其中一个峰（要求峰面积相对较大、要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰较稳定的共有峰）的峰面积作为）的峰面积作为1，计算其他，计算其他各共有指纹峰面积的比值。

各共有指纹峰面积的比值•各共有指纹峰面积比值必须相对固定各共有指纹峰面积比值必须相对固定峰面积比值的要求：峰面积比值的要求：•Ai≥20％％At: SD≤±20％％•10%At≤ Ai< 20%At: SD≤±25%•Ai< 10％％At：：峰面积比值不作要求，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间但必须标定相对保留时间•未达基线分离的共有峰，未达基线分离的共有峰，应计算该组应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间该组各峰的相对保留时间非共有峰面积中药材供试品的图谱与标准指中药材供试品的图谱与标准指纹图谱比较，非共有峰总面积不纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的得大于总峰面积的10％二、起草说明•目的在于说明制定指纹图谱检测标准目的在于说明制定指纹图谱检测标准中各个项目的理由，规定各项目指标中各个项目的理由，规定各项目指标的依据、技术条件和注意事项等的依据、技术条件和注意事项等•既要有理论解释，又要有实践工作的既要有理论解释，又要有实践工作的总结及试验数据总结及试验数据1、名称、汉语拼音•阐明确定该名称的理由与依据。

阐明确定该名称的理由与依据•已有国家标准或地方标准的中药材，应已有国家标准或地方标准的中药材，应引用标准上的名称引用标准上的名称•其他著作或文献上已记载的中药材，应其他著作或文献上已记载的中药材，应引用文献名，提供依据引用文献名，提供依据•新发现的中药材，应根据中药命名原则新发现的中药材，应根据中药命名原则进行命名进行命名2、来源•对于多来源的中药材，必须对于多来源的中药材，必须固定单一品种固定单一品种•对于多药用部位的中药材，必须对于多药用部位的中药材，必须固定单一药用部位固定单一药用部位•已已有有国国家家标标准准（（包包括括药药典典和和部部颁颁标标准准））的的中中药药材材，，应应引引用用国国家家标标准准；；已已有有地地方方标标准准的的中中药药材材，，除除引引用用地方标准外，必须附标准的复印件地方标准外，必须附标准的复印件•注注射射剂剂用用中中药药材材一一般般固固定定一一个个产产地地，，如如固固定定多多个个产产地，需制定各产地中药材的指纹图谱地，需制定各产地中药材的指纹图谱来源●中中药药材材一一般般固固定定一一个个采采收收期期，，如如固固定定多多个个采采收收期期，，需制定各采收期药材的指纹图谱。

需制定各采收期药材的指纹图谱●鼓鼓励励建建立立中中药药材材规规范范化化栽栽培培基基地地或或选选用用已已有有的的规规范化栽培基地生产的中药材范化栽培基地生产的中药材●中中药药材材的的炮炮制制必必须须固固定定一一种种方方法法，，并并制制订订严严格格的的炮炮制制技技术术标标准准操操作作规规范范应应根根据据《《中中药药材材炮炮制制加加工规范工规范》》进行详细叙述进行详细叙述3、供试品的制备•说明选用制备方法的依据说明选用制备方法的依据•供试品需要提取、纯化，应考察提取溶供试品需要提取、纯化，应考察提取溶剂、提取方法、纯化方法等，提取、纯剂、提取方法、纯化方法等，提取、纯化方法应力求最大限度地保留供试品中化方法应力求最大限度地保留供试品中的化学成分的化学成分•供试品需要粉碎检测，应考察粉碎方法、供试品需要粉碎检测，应考察粉碎方法、粒度等4、参照物的制备•参照物的选择及其依据参照物的选择及其依据根据供试品根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照中所含成分的性质，选择适宜的对照品或内标物作为参照物品或内标物作为参照物•试验样品制备的依据试验样品制备的依据根据检测方法根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备，的需要，选择适宜的方法进行制备，说明制备理由。

说明制备理由5、检测方法•检测方法的选择检测方法的选择•检测方法的原理检测方法的原理•色谱条件与系统适用性试验：包括色谱条件与系统适用性试验：包括色谱柱、流色谱柱、流动相、检测波长、流速、柱温动相、检测波长、流速、柱温等考察等考察•方法学考察资料和相关图谱（方法学考察资料和相关图谱（包括稳定性、精包括稳定性、精密度和重现性密度和重现性））•对于所含成分类型较多的中药材，如一种检测对于所含成分类型较多的中药材，如一种检测方法或一张图不能反映该中药材的固有特性，方法或一张图不能反映该中药材的固有特性，可以考虑采用多种检测方法或一种检测方法的可以考虑采用多种检测方法或一种检测方法的多种测定条件，建立多张指纹图谱多种测定条件，建立多张指纹图谱稳定性试验•主要考察供试品的稳定性主要考察供试品的稳定性•取同一供试品，分别在不同时间检测，考察取同一供试品，分别在不同时间检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性，确定检测时间性，确定检测时间•采用相似度软件进行评价，要求相似度大于采用相似度软件进行评价，要求相似度大于0.9•采用光谱方法检测的供试品，参照色谱方法采用光谱方法检测的供试品，参照色谱方法进行相应考察。

进行相应考察精密度试验•主要考察仪器的精密度主要考察仪器的精密度•取同一供试品，连续进样取同一供试品，连续进样5次以上，考察色谱峰的次以上，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性相对保留时间、峰面积比值的一致性•采用相似度软件评价，要求相似度大于采用相似度软件评价，要求相似度大于0.9•人工评价：人工评价：采用采用HPLC和和GC制定指纹图谱，在指制定指纹图谱，在指纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的面积比值的RSD不得大于不得大于3％，其他方法不得大于％，其他方法不得大于5％•采用光谱方法检测的供试品，采用光谱方法检测的供试品，RSD不得大于不得大于3％重现性试验：•主要考察实验方法的重现性主要考察实验方法的重现性•取同一批号的供试品取同一批号的供试品5份以上，按照供试品的制备份以上，按照供试品的制备方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相对方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性保留时间、峰面积比值的一致性•采用相似度软件评价，要求相似度大于采用相似度软件评价，要求相似度大于0.9•人工评价：人工评价：采用采用HPLC和和GC制定指纹图谱，在指制定指纹图谱，在指纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的面积比值的RSD不得大于不得大于3％，其他方法不得大于％，其他方法不得大于5％。

％•采用光谱方法检测的供试品，采用光谱方法检测的供试品，RSD不得大于不得大于3％6、指纹图谱及技术参数、指纹图谱及技术参数(1)指纹图谱§根根据据供供试试品品的的检检测测结结果果制制定定指指纹纹图图谱谱，，采采用用阿阿拉拉伯伯数数字字标示共有峰，用标示共有峰，用“S”标示参照物的峰标示参照物的峰§采采用用HPLC和和GC制制定定指指纹纹图图谱谱，，应应提提供供对对照照指指纹纹图图谱谱2倍倍以以上上的的记记录录图图，，以以考考察察样样品品中中的的主主要要成成分分是是否否完完全全出出峰§提提供供建建立立指指纹纹图图谱谱的的有有关关数数据据，，包包括括各各共共有有峰峰的的相相对对保保留留时时间间、、相相似似度度或或各各共共有有峰峰面面积积的的比比值值采采用用光光谱谱方方法法建立的指纹图谱，也必须提供相应的数据建立的指纹图谱，也必须提供相应的数据(2)共有指纹峰的标定共有指纹峰的标定•根据根据10批次以上供试品的检测结果，批次以上供试品的检测结果，标定中药材的共有指纹峰标定中药材的共有指纹峰•说明标定共有指纹峰的理由说明标定共有指纹峰的理由•附各批供试品的图谱附各批供试品的图谱(3)共有指纹峰面积的比值•根据根据10批次以上供试品图谱中各共有批次以上供试品图谱中各共有指纹峰面积的比值，计算平均比值。

指纹峰面积的比值，计算平均比值•列出各批供试品的检测数据列出各批供试品的检测数据•分析各批供试品的检测结果是否合格分析各批供试品的检测结果是否合格(4)非共有峰面积•计算计算10批次以上供试品图谱中非共批次以上供试品图谱中非共有峰总面积及占总峰面积的百分比有峰总面积及占总峰面积的百分比•列出各批供试品的检测数据列出各批供试品的检测数据•分析各批供试品非共有峰面积是否分析各批供试品非共有峰面积是否合格7、注射剂用中药材指纹图谱检测、注射剂用中药材指纹图谱检测标准（草案）书写格式标准（草案）书写格式•中药材的名称、来源中药材的名称、来源•供试品制备供试品制备•对照品溶液或内标物溶液的制备对照品溶液或内标物溶液的制备•测测定定方方法法（（包包括括仪仪器器、、试试剂剂、、测测定定条条件件和和测测定方法）定方法）•指纹图谱及各项技术参数指纹图谱及各项技术参数•起草说明起草说明三、中药材指纹图谱研究实例三、中药材指纹图谱研究实例(一一)肉苁蓉药材的指纹图谱研究肉苁蓉药材的指纹图谱研究Lichrosorb 250*4.6mm 10μμm（（大连依利特公大连依利特公司司Diamasil 200*4.6mm 5μμm（（迪马公迪马公司）司） Lichrospher250*4mm 5μμm(默克公司默克公司)1、色谱柱考察、色谱柱考察甲醇－水系统 乙腈－水系统0.095%磷酸乙腈- 0.095%磷酸系统2、流动相考察、流动相考察3、检测波长考察、检测波长考察4、精密度试验、精密度试验样品样品12345相关系数相关系数(中位数中位数)0.99300.99280.98310.99290.99665、稳定性试验、稳定性试验样品0h2h4h8h16h24h相关系数中位数）0.99250.98540.99890.99270.98020.9988样品12345相关系数（中位数）0.99760.99940.99340.99540.99696、重现性实验、重现性实验荒漠肉苁蓉荒漠肉苁蓉管花肉苁蓉管花肉苁蓉沙苁蓉沙苁蓉盐生肉苁蓉盐生肉苁蓉不同产地管花肉苁蓉不同产地管花肉苁蓉C. tubulosa指纹图谱指纹图谱不同寄主管花肉苁蓉指纹图谱相似度比较不同寄主管花肉苁蓉指纹图谱相似度比较样品样品中国柽柳中国柽柳甘蒙柽柳甘蒙柽柳短穗柽柳短穗柽柳细穗柽柳细穗柽柳甘肃柽柳甘肃柽柳直立柽柳直立柽柳相似度相似度0.99660.99660.98580.98580.98700.98700.99910.99910.99650.99650.93800.9380(二二)白鲜皮药材的指纹图谱研究白鲜皮药材的指纹图谱研究茵芋碱白鲜碱黄柏酮梣酮白鲜皮的对照指纹图谱白鲜皮的对照指纹图谱1、中药白鲜皮指纹图谱的建立、中药白鲜皮指纹图谱的建立特特征征区区种种内内指指纹纹区区2、不同产地白鲜皮的指纹图谱考察、不同产地白鲜皮的指纹图谱考察特特征征区区种种内内指指纹纹区区白鲜皮根皮与木心部分指纹图谱比较白鲜皮根皮与木心部分指纹图谱比较根根皮皮木木心心3、不同药用部位指纹图谱的区别、不同药用部位指纹图谱的区别(三三)红花药材的指纹图谱研究红花药材的指纹图谱研究红花商品药材指纹图谱红花商品药材指纹图谱红花商品药材指纹红花商品药材指纹123456红花商品药材指纹图谱红花商品药材指纹图谱新疆产红花指纹图谱新疆产红花指纹图谱(四四)黄芪药材的指纹图谱研究黄芪药材的指纹图谱研究1、色谱条件与系统适用性试验、色谱条件与系统适用性试验•色谱柱：色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂，型号为十八烷基键合硅胶为填充剂，型号为Polaris 5μ C18-A 250×4.6mm；；•检测器：分别以蒸发光散射和紫外二种检测器检测检测器：分别以蒸发光散射和紫外二种检测器检测，蒸发光散射检测，蒸发光散射检测器采用法国器采用法国SEDEX 75型，蒸发温度型，蒸发温度=40℃,氮气压力氮气压力=2.2 Bar，，灵敏度灵敏度=7，，Units/Volt=2000；；紫外检测波长为紫外检测波长为 280nm；；•柱温柱温：：30℃；；•理论塔板数：理论塔板数：按黄芪甲苷计，应不低于按黄芪甲苷计，应不低于3000；；•进样量：进样量：20ul；；•流动相：流动相：水－乙腈梯度洗脱水－乙腈梯度洗脱时间时间(min)流速（流速（ml/min））水水(%)乙腈乙腈(%)01.0973401.07030651.01585701.01585751.0973标样叠加图芒柄花素苷异黄烷苷-1异黄烷苷-3毛蕊异黄酮黄芪甲苷芒柄花素毛蕊异黄酮苷黄芪药材蒸发光散射检测器检测指纹图谱黄芪药材蒸发光散射检测器检测指纹图谱黄芪药材紫外检测器黄芪药材紫外检测器(280nm)检测指纹图谱检测指纹图谱黄芪甲苷芒柄花素毛蕊异黄酮苷 芒柄花素苷 毛蕊异黄酮 甘肃黑龙江陕西其他河北山西内蒙古辽宁不同产地黄芪蒸发光散射不同产地黄芪蒸发光散射检测器检测指纹图谱比较检测器检测指纹图谱比较不同产地黄芪药材紫外检不同产地黄芪药材紫外检测器检测指纹图谱比较测器检测指纹图谱比较陕西山西甘肃内蒙古黑龙江河北其他辽宁4 4、八个省、八个省5050种药材样品指纹图谱考察种药材样品指纹图谱考察8个省个省50种药材样品的紫外检测考察结果条形图（毛蕊异黄酮苷峰面积）种药材样品的紫外检测考察结果条形图（毛蕊异黄酮苷峰面积） 8个省个省50种药材皂苷类成分的考察图谱（黄芪甲苷峰面积）种药材皂苷类成分的考察图谱（黄芪甲苷峰面积） 5、黄芪药材、黄芪药材ELSD检测相似度结果检测相似度结果6、黄芪药材紫外检测相似度结果、黄芪药材紫外检测相似度结果7、黄芪药材、黄芪药材ELSD检测重现性考察检测重现性考察8、黄芪药材紫外检测重现性考察、黄芪药材紫外检测重现性考察(五五)柴胡药材挥发油指纹图谱研柴胡药材挥发油指纹图谱研究究柴胡药材芳香水的柴胡药材芳香水的GC对照指纹图谱对照指纹图谱Agilent HP-5，，30m×530mm×5mm DB-WAX 30×530 mm×1 mm DB-624 30×320 mm×1.8 mm Agilent HP-5，，30 m×3200 mm×0.25 mm 色谱柱比较色谱柱比较流速考察：流速考察：上图：柱流速上图：柱流速0.8 ml/min，， 中图：中图：1.0 ml/min，， 下图：下图：1.5 ml/min 升温程序考察：升温程序考察：初始初始100℃3℃/min升升至至170℃，保持，保持3min 初始初始60℃，保持，保持2min，， 3℃/min升至升至70℃，保持，保持3min，，5℃/min升至升至200℃，保持，保持3min 初始初始40℃，保持，保持2min，， 1℃/min升至升至50℃，保持，保持2min，，3℃/min升至升至70℃，保持，保持3min,7℃/min升至升至220℃，保，保持持3min 初始初始35℃，保持，保持2min，， 1℃/min升至升至40℃，保持，保持2min，，3℃/min升至升至60℃，，保持保持3min,7℃/min升至升至200℃，保持，保持3min 稳定性和精密度试验稳定性和精密度试验重现性试验重现性试验河北易县河北易县 北柴胡北柴胡 野生野生 河北安国河北安国 北柴胡北柴胡 内蒙古喀喇内蒙古喀喇沁旗锦山镇沁旗锦山镇 南柴胡南柴胡 野野生生 山西省宁山西省宁武县武县 南柴南柴胡胡 野生野生 北柴胡北柴胡南柴胡南柴胡栽培北柴栽培北柴胡胡栽培南柴栽培南柴胡胡第三部分第三部分 中成药指纹图谱的建立中成药指纹图谱的建立•供试品的制备方法供试品的制备方法•测定方法、条件的考察测定方法、条件的考察•中药材、中间体、成品的相关性考察中药材、中间体、成品的相关性考察•方法学考察：稳定性、精密度、重现性方法学考察：稳定性、精密度、重现性试验试验•指纹图谱的建立指纹图谱的建立•成品的稳定性试验成品的稳定性试验中药注射剂及其有效部位或中间体指纹图谱的检测标准定义：定义：•中药注射剂指纹图谱系指中药注射剂中药注射剂指纹图谱系指中药注射剂经适当处理后，采用一定的分析手段，经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该注射剂特性的共有得到的能够标示该注射剂特性的共有峰的图谱。

峰的图谱•要求：要求：以有效部位或中间体投料的中以有效部位或中间体投料的中药注射剂，还需制定有效部位或中间药注射剂，还需制定有效部位或中间体的指纹图谱体的指纹图谱一、指纹图谱的检测标准内容：内容： 供试品和参照物的制备、检测方供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数法、指纹图谱及技术参数1、供试品的制备、供试品的制备•要求：要求：根据注射剂、有效部位或中间体中根据注射剂、有效部位或中间体中所含化学成分的理化性质和检测方法的需所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备要，选择适宜的方法进行制备•注意：注意：制备方法必须确保该注射剂、有效制备方法必须确保该注射剂、有效部位或中间体主要化学成分在指纹图谱中部位或中间体主要化学成分在指纹图谱中的再现2、参照物的制备、参照物的制备•制定指纹图谱必须设立参照物，应根据供制定指纹图谱必须设立参照物，应根据供试品中所含化学成分的性质，选择适宜的试品中所含化学成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物；对照品作为参照物；•如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。

标物作为参照物•参照物的制备应根据检测方法的需要，选参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法择适宜的方法3. 测定方法测定方法•包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等•应根据注射剂、有效部位和中间体所含化学成分的应根据注射剂、有效部位和中间体所含化学成分的理化性质，选择适宜的检测方法建议优先考虑色理化性质，选择适宜的检测方法建议优先考虑色谱方法•对于成分复杂的注射剂、有效部位和中间体，特别对于成分复杂的注射剂、有效部位和中间体，特别是复方中药注射剂，是复方中药注射剂，必要时可以考虑采用多种检测必要时可以考虑采用多种检测方法，建立多张指纹图谱方法，建立多张指纹图谱•制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定，采用光谱方法制定指纹图谱，定条件等必须固定，采用光谱方法制定指纹图谱，相应的测定条件也必须固定相应的测定条件也必须固定4.指纹图谱及技术参数指纹图谱及技术参数(1)指纹图谱指纹图谱•根据供试品指纹图谱的检测结果，建立指纹图谱根据供试品指纹图谱的检测结果，建立指纹图谱•采用采用HPLC和和GC制定指纹图谱，制定指纹图谱，根据样品中所含根据样品中所含成分的情况确定记录时间成分的情况确定记录时间；采用薄层扫描法制定；采用薄层扫描法制定指纹图谱，必须提供指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱从原点至溶剂前沿的图谱；；采用光谱法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相采用光谱法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供应规定提供全谱全谱。

•对于化学成分类型复杂的中药注射剂、有效部位对于化学成分类型复杂的中药注射剂、有效部位和中间体，特别是中药复方注射剂，和中间体，特别是中药复方注射剂，必要时建立必要时建立多张指纹图谱多张指纹图谱2.共有指纹峰的标定共有指纹峰的标定•根据根据10批次以上供试品的检测结果，标定批次以上供试品的检测结果，标定共有指纹峰共有指纹峰•色谱法采用相对保留时间标定指纹峰，光色谱法采用相对保留时间标定指纹峰，光谱法采用波长或波数标定指纹峰谱法采用波长或波数标定指纹峰•色谱峰的相对保留时间根据参照物的保留色谱峰的相对保留时间根据参照物的保留时间计算时间计算3、指纹图谱的评价、指纹图谱的评价•以以指纹图谱相似度评价软件评价指纹图谱相似度评价软件评价•以色谱峰面积的比值评价以色谱峰面积的比值评价共有指纹峰面积的比值共有指纹峰面积的比值•以以对照品对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；•以以内标物内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰）的峰面一个峰（要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰）的峰面积作为积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。

计算其他各共有指纹峰面积的比值•未达基线分离的共有峰未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间面积，同时标定该组各峰的相对保留时间•以光谱方法制定指纹图谱以光谱方法制定指纹图谱，参照色谱方法的相应要求执行，参照色谱方法的相应要求执行峰面积比值的要求：峰面积比值的要求：保留时间小于或等于保留时间小于或等于30分钟的共有峰：分钟的共有峰： Ai≥20％％At：：SD≤±20％；％； 20％％At>Ai≥ 10％％At：：SD≤±25％；％； 10 ％％At>Ai≥ 5％％At：：SD≤±30％；％； Ai<5％％At：：峰面积比值不作要求，但必须标定相峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间对保留时间保留时间超过保留时间超过30分钟的共有峰：分钟的共有峰： Ai ≥ 10％％At：：按上述规定执行；按上述规定执行； Ai < 10％％At：：峰面积比值不作要求，但必须标定峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间相对保留时间非共有峰面积非共有峰面积 供试品图谱与指纹图谱比较，供试品图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积非共有峰总面积不得大于总峰面积的的5％。

％(5) 中药材、有效部位、中间体和注中药材、有效部位、中间体和注射剂指纹图谱之间的相关性射剂指纹图谱之间的相关性 为了确保制备工艺的科学性和稳为了确保制备工艺的科学性和稳定性，应根据中药材、有效部位、定性，应根据中药材、有效部位、中间体和注射剂的指纹图谱，标定中间体和注射剂的指纹图谱，标定各图谱之间的相关性各图谱之间的相关性二、起草说明二、起草说明•目的在于说明制定检测标准中各个项目目的在于说明制定检测标准中各个项目的理由，规定各项目指标的依据、技术的理由，规定各项目指标的依据、技术条件和注意事项等，既要有理论解释，条件和注意事项等，既要有理论解释，又要有实践工作的总结及试验数据又要有实践工作的总结及试验数据1 1、供试品的制备、供试品的制备 •应说明选用制备方法的依据应说明选用制备方法的依据•如供试品需要提取、纯化，应考察提取如供试品需要提取、纯化，应考察提取溶剂、提取方法、纯化方法等，提取、溶剂、提取方法、纯化方法等，提取、纯化方法应力求最大限度地保留供试品纯化方法应力求最大限度地保留供试品中的化学成分中的化学成分 2 2、参照物的制备、参照物的制备 •应说明参照物的选择和试验样品制备的应说明参照物的选择和试验样品制备的依据。

依据•应根据供试品中所含成分的性质，选择应根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品或内标物作为参照物参适宜的对照品或内标物作为参照物参照物的制备应根据检测方法的需要，选照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行，并说明制备理由择适宜的方法进行，并说明制备理由 3、、检测方法检测方法 •根据供试品的特点和所含化学成分的理化性质选择相应的根据供试品的特点和所含化学成分的理化性质选择相应的检测方法检测方法•应说明选择检测方法的依据和该检测方法的原理，确定该应说明选择检测方法的依据和该检测方法的原理，确定该检测方法的方法学考察资料和相关图（包括稳定性、精密检测方法的方法学考察资料和相关图（包括稳定性、精密度和重现性）度和重现性）•对于所含成分类型较多的中药注射剂、有效部位和中间体，对于所含成分类型较多的中药注射剂、有效部位和中间体，特别是复方中药注射剂，一种检测方法或一张图谱不能反特别是复方中药注射剂，一种检测方法或一张图谱不能反映该注射剂、有效部位和中间体的固有特性，必要时可以映该注射剂、有效部位和中间体的固有特性，必要时可以考虑采用多种检测方法或一种检测方法的多种测定条件，考虑采用多种检测方法或一种检测方法的多种测定条件，制备多张指纹图谱。

制备多张指纹图谱•制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板等必须固定厂家和制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板等必须固定厂家和型号、规格，试剂、测定条件等也必须相应固定型号、规格，试剂、测定条件等也必须相应固定•采用光谱法建立指纹图谱，其相应的检测条件也必须固定采用光谱法建立指纹图谱，其相应的检测条件也必须固定稳定性、精密度、重现性的考察方法和要求参见中药材部稳定性、精密度、重现性的考察方法和要求参见中药材部分 4、、指纹图谱及技术参数指纹图谱及技术参数 (1)指纹图谱指纹图谱 •根根据据供供试试品品图图谱谱所所给给出出的的相相关关参参数数，，制制定定指指纹纹图图谱谱，，采采用用阿阿拉拉伯伯数数字字标标示示共共有有峰峰，，用用“S”标标示示参参照照物物的的峰峰采采用用高高效效液液相相色色谱谱法法和和气气相相色色谱谱法法制制定定指指纹纹图图谱谱，，应应提提供供2倍倍于于对对照照指指纹纹图图谱谱的的记记录录图图，，以以考考察察样样品品中中的的主主要要成成分分是否全部出峰是否全部出峰•提提供供建建立立对对照照指指纹纹图图谱谱的的有有关关数数据据，，包包括括各各共共有有峰峰的的相相对对保保留留时时间间、、各各共共有有峰峰面面积积的的比比值值。

采采用用光光谱谱方方法法建建立立的的指指纹纹图图谱谱，，也也必必须须提提供供相应的数据相应的数据 (2)共有指纹峰的标定共有指纹峰的标定 •应根据应根据10批次以上供试品图谱的检测结批次以上供试品图谱的检测结果，标定中药注射剂、有效部位和中间果，标定中药注射剂、有效部位和中间体的共有指纹峰体的共有指纹峰•说明标定共有指纹峰的理由，并附各批说明标定共有指纹峰的理由，并附各批供试品图谱供试品图谱 (3) (3) 共有指纹峰面积的比值共有指纹峰面积的比值 •应根据应根据10批次以上供试品图谱中共有指批次以上供试品图谱中共有指纹峰面积的比值，计算平均比值，列出纹峰面积的比值，计算平均比值，列出各批供试品的检测数据各批供试品的检测数据 (4)非共有峰面积非共有峰面积 •计算计算10批次以上供试品图谱中非共有峰批次以上供试品图谱中非共有峰面积及占总峰面积的百分比，列出各批面积及占总峰面积的百分比，列出各批供试品的检测数据供试品的检测数据 (5)中药材、有效部位、中间体和中药材、有效部位、中间体和注射剂指纹图谱之间的相关性注射剂指纹图谱之间的相关性 •应根据中药材、有效部位、中间体和注应根据中药材、有效部位、中间体和注射剂的指纹图谱，标定各指纹图谱之间射剂的指纹图谱，标定各指纹图谱之间的相关性。

必要时可采用加入某一中药的相关性必要时可采用加入某一中药材、有效部位或中间体的供试品或制备材、有效部位或中间体的供试品或制备某一中药材、有效部位或中间体阴性供某一中药材、有效部位或中间体阴性供试品的方法标定各指纹图谱之间的相关试品的方法标定各指纹图谱之间的相关性提供相关性研究的指纹图谱提供相关性研究的指纹图谱 (6)中试产品的指纹图谱中试产品的指纹图谱•申报临床的中药注射剂必须提供三批以申报临床的中药注射剂必须提供三批以上中试产品的指纹图谱上中试产品的指纹图谱•申报生产的中药注射剂必须提供十批以申报生产的中药注射剂必须提供十批以上中试产品的指纹图谱上中试产品的指纹图谱5、中药注射剂指纹图谱检测标准（草案）、中药注射剂指纹图谱检测标准（草案）书写格式书写格式(1)供试品的制备供试品的制备(2)对照品溶液或内标物溶液的制备对照品溶液或内标物溶液的制备(3)测测定定方方法法（（包包括括仪仪器器、、试试剂剂、、测测定定条条件件和和测测定定方方法）法）(4)指纹图谱及各项技术参数指纹图谱及各项技术参数(5)起草说明起草说明(6)有有效效部部位位或或中中间间体体的的指指纹纹图图谱谱检检测测标标准准及及起起草草说说明明三、中药注射剂指纹图谱研究实例三、中药注射剂指纹图谱研究实例参芪注射液指纹图谱的研究参芪注射液指纹图谱的研究处方：黄芪、党参处方：黄芪、党参黄芪药材指纹图谱黄芪药材指纹图谱十批黄芪指纹图谱相似度结果十批黄芪指纹图谱相似度结果党参药材指纹图谱党参药材指纹图谱十批党参指纹图谱相似度结果十批党参指纹图谱相似度结果参芪扶正注射液中间体指纹图谱参芪扶正注射液中间体指纹图谱10批参芪扶正注射液中间体指纹图谱相似度结果批参芪扶正注射液中间体指纹图谱相似度结果十批参芪扶正注射液指纹图谱十批参芪扶正注射液指纹图谱参芪扶正注射液指纹图谱相似度结果参芪扶正注射液指纹图谱相似度结果党参参芪中间体黄芪注射液党参、黄芪党参、黄芪——中间体中间体——注射液相关性注射液相关性注射液中间体、黄芪和党参提取液注射液中间体、黄芪和党参提取液的总离子流图的总离子流图不同检测波长下的指纹图谱不同检测波长下的指纹图谱指纹图谱中部分指纹峰的结构确证指纹图谱中部分指纹峰的结构确证毛蕊异黄酮葡萄糖苷芒柄花素葡萄糖苷9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-葡萄糖苷tR＝31.446min毛蕊异黄酮葡萄糖苷 ¨447: M+ H¨469: M+Na¨915: 2M+Na ¨M=446 tR＝42.763min芒柄花素葡萄糖苷¨431: M+ H ¨453: M+Na ¨883: 2M+Na ¨M=430第四部分第四部分 指纹图谱的其他作用指纹图谱的其他作用一、指纹图谱在黄芪注射液制一、指纹图谱在黄芪注射液制备工艺统一中的作用备工艺统一中的作用8个厂家注射液皂苷成分不同企业生产注射液指纹图谱不同企业生产注射液指纹图谱比较比较(ELSD检测检测)8个厂家注射液黄酮类成分不同企业生产注射液指纹图谱不同企业生产注射液指纹图谱比较比较(紫外检测紫外检测)根据三种制备工艺制备的注射液根据三种制备工艺制备的注射液紫外检测指纹图谱比较紫外检测指纹图谱比较 药材：山西浑源药材：山西浑源白：部颁标准白：部颁标准红：企业红：企业1黄：企业黄：企业2根据三种制备工艺制备的注射液根据三种制备工艺制备的注射液ELSD检测检测指纹图谱比较指纹图谱比较 药材：山西浑源药材：山西浑源白：部颁标准白：部颁标准红：企业红：企业1黄：企业黄：企业2二、柴胡注射液的指纹图谱研究二、柴胡注射液的指纹图谱研究12个企业第一阶段送检样品考察图谱（个企业第一阶段送检样品考察图谱（1 1）） 江西银涛江西银涛 批号批号 020920020920 河南新乡新辉河南新乡新辉 批号批号 021010021010 焦作康华焦作康华 批号批号 020705020705 西安黄河西安黄河 批号批号 020828020828 12个企业第一阶段送检样品考察图谱（个企业第一阶段送检样品考察图谱（2 2））四川升和四川升和 批号批号 020822020822 昆明兴中昆明兴中 批号批号 020307020307 河南百泉河南百泉 批号批号 020703020703 广东博罗先锋广东博罗先锋 批号批号 020703020703 12个企业第一阶段送检样品考察图谱（个企业第一阶段送检样品考察图谱（3 3））山西晋新双鹤山西晋新双鹤 批号批号 02081920208192 河南浙川河南浙川 批号批号 020602020602 四川升和沪医四川升和沪医 批号批号 020822020822 三九万荣三九万荣 批号批号 020607020607 研究单位采用三种制备工艺生产的注射液研究单位采用三种制备工艺生产的注射液指纹图谱比较指纹图谱比较兰：部颁标准兰：部颁标准红：西安黄河红：西安黄河绿：陕西金方绿：陕西金方药材：山西晋新双鹤药材：山西晋新双鹤提供提供 从图可看出，虽然两个企业注射液制备工艺与从图可看出，虽然两个企业注射液制备工艺与《《部颁标准部颁标准》》的工艺有的工艺有差异，但用其生产工艺制备的注射液样品，与按差异，但用其生产工艺制备的注射液样品，与按《《部颁标准部颁标准》》制备的样品制备的样品进行指纹图谱比较，三者指纹图相差并不很大，共有峰的个数基本一致，进行指纹图谱比较，三者指纹图相差并不很大，共有峰的个数基本一致，相关性良好。

相关性良好 采用西安黄河提供的药材，按采用西安黄河提供的药材，按《《部颁标准部颁标准》》制备制备的三个平行样的指纹图谱比较的三个平行样的指纹图谱比较三三个个样样品品的的GC－－FID色色谱谱图图各各色色谱谱峰峰分分离离良良好好，，基基线线无无干干扰扰，，保保留留时时间间从从3分分钟钟到到40分分钟钟内内，，均均呈呈现现大大小小约约12个个（（组组））共共有有峰峰，，三三个个色色谱图相关性良好谱图相关性良好采用山西晋新双鹤提供的药材，按采用山西晋新双鹤提供的药材，按《《部颁标准部颁标准》》制备的三个平行样的指纹图谱比较制备的三个平行样的指纹图谱比较 三三个个样样品品的的GC－－FID色色谱谱图图各各色色谱谱峰峰分分离离良良好好，，基基线线无无干干扰扰，，保保留留时时间间从从3分分钟钟到到40分分钟钟内内，，均均呈呈现现大大小小约约12个个（（组组））共共有有峰峰，，三三个个色色谱图相关性好谱图相关性好利用几个企业的药材在浸泡过程中利用几个企业的药材在浸泡过程中调酸加盐调酸加盐制得制得的样品进行的紫外光谱图及的样品进行的紫外光谱图及GCGC－－FIDFID图比较（图比较（2 2））未调酸未加盐未调酸未加盐 PH=6.42 PH=6.42 A A276.60nm276.60nm＝＝0.5140 0.5140 A A250.00nm250.00nm＝＝0.31770.3177 调酸加盐调酸加盐 PH=6.57 PH=6.57 A A277.80nm277.80nm＝＝0.7905 0.7905 A A248.60nm248.60nm＝＝0.41580.4158 四川升和药材四川升和药材 利用几个企业的药材在浸泡过程中调酸加盐制得的样品进行的紫外光谱图及GC－FID图比较（3）未加盐未调酸未加盐未调酸 PH=6.50 A278.60nm＝＝0.1186 A255.00nm＝＝0.1006 加盐调酸加盐调酸 PH=6.92 A278.40nm＝＝0.3935 A245.80nm＝＝0.1556 四川衡生药材四川衡生药材 第五部分、指纹图谱研究的发展第五部分、指纹图谱研究的发展趋势趋势1、色谱－光谱、色谱－波谱联用、色谱－光谱、色谱－波谱联用DADUV图谱图谱MS图谱图谱1H-NMR图谱图谱MSNMR2、中药复杂体系的谱效学研究，阐明有效组分、中药复杂体系的谱效学研究，阐明有效组分A组分组分B组分组分C组分组分D组分组分E组分组分活性筛选活性筛选计算机分析计算机分析阐明有效组分阐明有效组分3、指纹图谱在中药复杂体系的药代动力学、指纹图谱在中药复杂体系的药代动力学研究中的应用研究中的应用中药提取物中药提取物的指纹图谱的指纹图谱血液指血液指纹图谱纹图谱尿液指尿液指纹图谱纹图谱粪便指粪便指纹图谱纹图谱脏器指脏器指纹图谱纹图谱谢谢 谢！谢！屠鹏飞屠鹏飞100083，北京市学院路，北京市学院路38号号北京大学中医药现代研究中心北京大学中医药现代研究中心()：：010－－82802750email: pengfeitu@。