免疫组化和荧光.docx

免疫组化（石蜡切片）（一）脱腊，水化1•二甲苯脱腊 10分钟x3次 （1、2、3） （若标本从冰箱中拿出，复温37°C 30—40分钟 放入湿盒中）（此时间可以自己掌握）2.水化无水酒精5 分钟1可以为两次无水酒精，两次 95%酒精，时间可95%无水酒精5 分钟2为 1 分钟75%无水酒精5 分钟3.PBS洗5分钟x3次（二） 抗原修复 10ml（0.2mol/l）+190ml=200ml电炉或水浴锅加热『0.01MO/1枸橼酸钠（2/3）溶液（PH=6.0）至90—95C』 放入切片，加热10-15分钟 （新鲜切片）25-30分钟（久放切片） （自然冷却到室温）（三） 染色（四） PBS浸泡5分钟，先放玻片，后加PBS.（五） 重复（1）步骤（六） 加3%H2O25-10分钟避光（H2O2抑制内源性过氧化物酶，使DAB显色，降低非特异性染色；放 入湿盒目的：1、避光 2、保湿）（七） PBS洗3分钟x3次或5分钟x2次（此时可将湿盒加温）（八） 羊血清（A蓝色）30分钟（5%BSA封闭30分钟）37C（恒温床）（封闭被破坏抗原，此抗原可与 一抗结合，减少非特异性染色）（九） 加一抗4C过夜：（稍微延长时间）（1:100TLR2, 1:100TLR4）用 PBS稀释十） 回温 37C40 分钟（恒温床）（此时间也可自己掌握）（十^一 ） PBS洗5分钟x2次（十二）二抗（生物素B黄色）37°C 40分钟（恒温床）（十三）PBS洗5分钟x3次 （多洗）（十四）三抗（亲和素C橙色）37°C 30分钟（十五）PBS洗5分钟x3次（十六）1ml蒸馏水，A、B、C液各1滴（十七）100ul枪染色 看镜 用水冲洗十八）苏木素复染 数5下 用水冲洗 看镜（十九）PBS洗5分钟x2次（二十）酒精依次脱水 75 %'七 ％ 无水 序5分钟二十一） 二甲苯透明 5-10分钟5分钟x2次二十二） 中性树胶封片、免疫组化1.蜡块制作：配制 4%多聚甲醛，取新鲜组织浸入，固定24小时后，切块放入脱水机中脱水，后在包 埋机中石蜡封埋成块。

2•将蜡块切成4um组织片，58C烘片12小时3•常规脱蜡至水：将载玻片浸入二甲苯I、II、III各10分钟，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75% 乙醇各5分钟，蒸馏水洗30秒钟4.用 3%的过氧化氢封闭 30 分钟5•水洗5分钟，PBS缓冲液浸泡5分钟6•抗原修复:在抗原修复盒中加入0.01M枸橼酸钠缓冲液，将玻片浸入，加热到98°C持续20分钟， 后自然冷却至室温7. PBS缓冲液洗5分钟x3次8•在玻片组织片上滴加羊封闭血清，放入湿盒于37C恒温箱中放置20分钟9•倾去封闭血清，小心拭去组织片周围液体，后滴加一抗（兔抗人P75NTR、兔抗人CD133、鼠抗人 a-SMA） 1： 50，覆盖组织片4C冰箱，过夜磷酸盐代替一抗，作为阴性对照10. 取出玻片，放置室温下11. PBS缓冲液洗5分钟x3次12. 滴加二抗工作液，覆盖组织片，放入湿盒于37C恒温箱中放置30分钟13. PBS缓冲液洗5分钟x3次14. 滴加SABC工作液，放入湿盒于37C恒温箱中放置30分钟15. PBS缓冲液洗5分钟x3次16. 滴加DAB显色液避光10分钟17. 水洗中止反应18. 滴加苏木素复染核 1 分钟。

19. 水洗使组织返蓝20•脱水，将载玻片依次浸入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、二甲苯III、II、I各2分钟 21.晾干，封片剂封片二、免疫荧光1. 将免疫组化制作的蜡块切成4um组织片，58C烘片12小时2. 常规脱蜡至水：将载玻片浸入二甲苯I、II、III各10分钟，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙 醇各 5 分钟，蒸馏水洗30秒钟3. 水洗 5 分钟， PBS 缓冲液浸泡 5 分钟4. 抗原修复:在抗原修复盒中加入0.01M枸橼酸钠缓冲液，将玻片浸入，加热到98C持续20分钟，后自 然冷却至室温5. PBS缓冲液洗5分钟x3次6•在玻片组织片上滴加羊封闭血清，放入湿盒于37C恒温箱中放置20分钟7. 倾去封闭血清，小心拭去组织片周围液体，后滴加一抗（兔抗人CD133、鼠抗人a-SMA） 1： 50，覆 盖组织片4C冰箱，过夜磷酸盐代替一抗，作为阴性对照8. 取出玻片，放置室温下9. PBS缓冲液洗5分钟x3次10. 滴加荧光二抗工作液（1： 300），覆盖组织片，避光、放入湿盒于37C恒温箱中放置30分钟11. PBS缓冲液洗5分钟x3次12. 滴加DAPI染液染核5min。

13. PBS缓冲液洗5分钟x3次14 缓冲甘油封片，荧光显微镜下阅片。