基因工程载体课件.ppt

第三章第三章 基因工程载体基因工程载体生物科学与技术学院基因工程载体基因工程载体的概念基因工程载体的概念把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分复制的起始区：复制的起始区：能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制选择标记基因区：选择标记基因区：可以筛选重组体多克隆位点：多克隆位点：方便外源基因的插入第一节第一节 质粒载体质粒载体质粒（质粒（plasmidplasmid）：）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中质粒质粒染色体染色体质粒的一般生物学特性：质粒的一般生物学特性：u分子大小差异大：分子大小差异大：1—200 kb1—200 kbu编码基因少：编码基因少：2—32—3个中等大小的蛋白质个中等大小的蛋白质个中等大小的蛋白质个中等大小的蛋白质。

如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）菌一些额外的特性（非必须）菌一些额外的特性（非必须）菌一些额外的特性（非必须）u形状：形状：双链环状双链环状双链环状双链环状DNADNA；；；；线线性双性双性双性双链链DNADNA；超螺旋等超螺旋等超螺旋等超螺旋等3 3基因工程载体基因工程载体u质粒的空间构型：质粒的空间构型：u质粒空间构型与电泳速率：质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢1.共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA，cccDNA)，呈超螺旋（SC）（super coil）2.开环DNA（open circular，ocDNA），一条链上有一至数个缺口3.线形DNA（linear，lDNA）4 4基因工程载体基因工程载体u质粒的类型：质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 1、接合型质粒（能自我转移）：除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带、接合型质粒（能自我转移）：除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。

有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因如：如：F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中不不符合基因工程的安全要求符合基因工程的安全要求2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞如如R质粒（抗生素抗性质粒）和质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素质粒（大肠杆菌素colicin ）符合基符合基因工程的安全要求因工程的安全要求大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠），对于其他不能分泌特异性大肠杆菌素免疫蛋白（杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数量的作用。

量的作用 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 5 5基因工程载体基因工程载体u质粒的复制类型质粒的复制类型严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid）：）：拷贝数少，只有拷贝数少，只有拷贝数少，只有拷贝数少，只有1—31—3份拷贝接合型质（接合型质（接合型质（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）粒分子量大，一般属严紧型）粒分子量大，一般属严紧型）粒分子量大，一般属严紧型）松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmid）：）：拷贝数多，有拷贝数多，有拷贝数多，有拷贝数多，有10—6010—60份拷贝非接合型质（非接合型质（非接合型质（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）粒分子量小，一般属松弛型）粒分子量小，一般属松弛型）粒分子量小，一般属松弛型）u质粒的不相容性质粒的不相容性又称质粒的不亲和性，在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同又称质粒的不亲和性，在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性,又又称质粒的不亲和性。

称质粒的不亲和性6 6基因工程载体基因工程载体u质粒的复制过程质粒的复制过程质粒的复制主要是通过质粒的复制主要是通过θ型复制型复制和和滚环复制滚环复制两种方式之一进行的，其中以两种方式之一进行的，其中以θ型型复制为主在复制为主在θ型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制Ori复制复制起起点点θ θ型复制型复制型复制型复制7 7基因工程载体基因工程载体滚环复制滚环复制滚环复制滚环复制在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制8 8基因工程载体基因工程载体复制起点复制起点(ori)(ori)区的功能区的功能u复复制制起起点点是是一一段段特特定定的的DNA序序列列，，长长约约几几百百碱碱基基对对，，在在其其相相关关的的调调控控元元件件中中含含有由质粒或宿主染色体编码的、参与有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点合成起始调控因子的结合位点u在在大大多多数数质质粒粒中中，，与与复复制制有有关关的的蛋蛋白白质质基基因因位位于于ori序序列列附附近近，，因因此此ori位位点点周周围围的小范围的小范围DNA是质粒复制所必需的。

是质粒复制所必需的u如如果果质质粒粒DNA的的大大部部分分区区域域被被去去掉掉，，而而只只保保留留质质粒粒的的ori序序列列，，而而且且质质粒粒是是环环状状的，则质粒仍然能进行复制的，则质粒仍然能进行复制u将将oriori区区克克隆隆到到一一个个不不能能自自主主复复制制的的环环状状双双链链DNADNA分分子子上上并并引引入入到到原原核核细细胞胞后后，，该该重重组组DNADNA具具有有自自主主复复制制能能力力分分子子克克隆隆中中常常用用的的质质粒粒载载体体就就是是以以这这种种方方法法构构建建的，同时用这种方法可以确定哪部分的，同时用这种方法可以确定哪部分DNADNA是是oriori区并研究区并研究oriori区的功能区的功能uoriori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数9 9基因工程载体基因工程载体质粒的命名质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。

1010基因工程载体基因工程载体质粒载体的构建质粒载体的构建u天然质粒的局限性天然质粒的局限性1、分子量大，拷贝数低，第一个用于基因克隆的天然质粒、分子量大，拷贝数低，第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长，分子长 9.1 kb但只但只有一个有一个EcoR I切点充当克隆位点，切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志作为筛选标志EColR I 酶切位点位于酶切位点位于Tetr 基因外基因外部，外源基因插入不会引起筛选基因失活，因此无法区别重组体和野生型质粒部，外源基因插入不会引起筛选基因失活，因此无法区别重组体和野生型质粒2、天然质粒、天然质粒ColE1质粒，长度为质粒，长度为6.3 kb，，唯一的唯一的EcoRI酶切位点位于筛选标志基因大肠杆酶切位点位于筛选标志基因大肠杆菌素菌素E1（（colicin E1）内部colicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成质粒的菌，形成“噬菌斑噬菌斑”可以通过插入失活筛选但细菌群体容易自发突变出抗以通过插入失活筛选但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞u质粒载体的发展概况质粒载体的发展概况第一阶段（第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322。

第二阶段：增大载体容量第二阶段：增大载体容量(降低载体长度降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如如pUC系列载体系列载体第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含系列载体，含T3，，T7，，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体启动子载体，表达型载体及各种探针型载体1111基因工程载体基因工程载体理想质粒载体必须具备的基本条件：理想质粒载体必须具备的基本条件：u1、具有复制起点（ORI）u2、具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因u3、若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断且插入后不影响复制功能u4、具有较小的分子量和较高的拷贝数1212基因工程载体基因工程载体质粒的选择标记及其工作原理：质粒的选择标记及其工作原理：uu抗菌素抗性抗菌素抗性抗菌素抗性抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记.氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr））:青霉素的衍生物氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。

Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环卡那霉素抗性（卡那霉素抗性（Kanr）） :卡那霉素通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读，从而杀死细菌Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用四环素抗性（四环素抗性（Tetr））:四环素通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成杀死生长的细菌Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内链霉素抗性（链霉素抗性（Strr）） :链霉素通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译，从而杀死细菌Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用氯霉素抗性（氯霉素抗性（Cmlr））:氯霉素通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成杀死生长的细菌Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活1313基因工程载体基因工程载体人工构建的质粒载体的类型人工构建的质粒载体的类型u高拷贝数的质粒载体高拷贝数的质粒载体pColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数1000—3000个。

适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物u低拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低，不适合大量扩增DNA用但当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体如pLG338、pLG339、pHSG415等u失控的质粒载体失控的质粒载体温度敏感型复制控制质粒，温度低于37度，拷贝数很少； 温度增加，大于40度时，拷贝数会很快增加到1000个以上B. E. Uhlin于1979年构建的载体如pBEU1、pBEU2等1414基因工程载体基因工程载体u插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部如pDF41、pDF42、pBR329u正选择的质粒载体正选择的质粒载体直接选择转化后的细胞只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长如pUR2、pTR262等目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体u表达型质粒载体表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。

u克隆质粒载体克隆质粒载体专用于基因和DNA片段无性繁殖的质粒载体纯粹的获取基因和DNA片段1515基因工程载体基因工程载体常用的质粒载体常用的质粒载体pBR3221、元件来源、元件来源复制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点）的高拷贝型复制起点Ampr基因基因pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因2、长度、长度4363bp3、选择标记、选择标记氨苄青霉素和四环素抗性氨苄青霉素和四环素抗性4、克隆位点、克隆位点24个克隆位点，个克隆位点，其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、、Hind Ⅲ、、Sal I）；）； 3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、、PvuI、、Pst I）1616基因工程载体基因工程载体1717基因工程载体基因工程载体利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程 BamHI片段片段(Tcr) pBR322PstI(Apr)片段片段重组分子重组分子ⅡⅡ(Aps Tcr) PstI片段片段 外源外源DNABamHI片段片段重组分子重组分子I(Apr Tcs））分别转化分别转化E.coli(ApS TcS) 重组分子重组分子ⅡⅡ(Aps Tcr)影印到影印到Tc平板上平板上Apr Tcr为原载体为原载体即为非重组子即为非重组子 影印到影印到Ap平板上平板上重组分子重组分子I (Apr Tcs））涂布涂布Ap平板平板Apr转化子转化子 涂布涂布Tc平板平板Tcr转化子转化子Apr TcS为重组子为重组子ApS Tcr为重组子为重组子1818基因工程载体基因工程载体影印影印1919基因工程载体基因工程载体pBR322的优点的优点双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet中都死亡。

获得载体的寄主细胞中都死亡获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet其中之一中死亡其中之一中死亡分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好载体越小越好 >10kb的的DNA在纯化过程中容易断裂在纯化过程中容易断裂高拷贝数高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（（mobilization）不能通过接合转移不能通过接合转移pBR322的缺点的缺点保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mob）的作用位点能够被）的作用位点能够被pColK质粒编码的质粒编码的mob蛋白识别，蛋白识别，如果再有如果再有F质粒的参与，就有可能转移！质粒的参与，就有可能转移！2020基因工程载体基因工程载体pBR322的改良的改良u删除删除mobmob识别位点识别位点如如pAT153，，pBR322的改造衍生的改造衍生质粒粒，除去了，除去了mob识别位点，同时增加质粒的识别位点，同时增加质粒的拷贝数u改造改造EcoR I 位点位点如如pBR325，，使使EcoRI 也成为插入失活型位点在也成为插入失活型位点在pBR322位点上接入一段来自位点上接入一段来自噬菌体噬菌体PICm的的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。

cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点cmlr2121基因工程载体基因工程载体常用的质粒载体常用的质粒载体pUC系列系列U U U University of niversity of niversity of niversity of C C C Californiaaliforniaaliforniaalifornia的的的的J. MessingJ. MessingJ. MessingJ. Messing和和和和J. VieriaJ. VieriaJ. VieriaJ. Vieria于于于于1978197819781978年，在年，在年，在年，在pBR322pBR322pBR322pBR322的基础上改造的基础上改造的基础上改造的基础上改造而成属正选择载体属正选择载体属正选择载体属正选择载体如pUC7pUC7pUC7pUC7、、、、pUC8pUC8pUC8pUC8、、、、pUC9pUC9pUC9pUC9、、、、pUC10pUC10pUC10pUC10、、、、pUC11pUC11pUC11pUC11、、、、pUC18pUC18pUC18pUC18、、、、pUC19pUC19pUC19pUC19。

1 1、元件来源、元件来源复制起点复制起点复制起点复制起点ori---pBR322ori---pBR322ori---pBR322ori---pBR322的的的的 orioriorioriAmpAmpAmpAmpr r r r 基因基因基因基因---pBR322---pBR322---pBR322---pBR322的的的的AmpAmpAmpAmpr r r r基因基因基因基因大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌ββββ- - - -半乳糖基因（半乳糖基因（半乳糖基因（半乳糖基因（lacZ’lacZ’lacZ’lacZ’基因）基因）基因）基因）多克隆位点（多克隆位点（多克隆位点（多克隆位点（MCSMCSMCSMCS）区段）区段）区段）区段------------位于位于位于位于lacZ’lacZ’lacZ’lacZ’基因基因基因基因中的靠近中的靠近中的靠近中的靠近5`-5`-5`-5`-端2 2、长度、长度约约约约2.7kb2.7kb2.7kb2.7kb3 3、克隆位点、克隆位点10101010个连续的单一限制酶切位点，位于个连续的单一限制酶切位点，位于个连续的单一限制酶切位点，位于个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’lacZ’lacZ’lacZ’基因的基因的基因的基因的5`5`5`5`端。

端4 4 4 4、、、、选择标记选择标记PUC系列质粒载体的选择标记是系列质粒载体的选择标记是Ampicillin 抗性和抗性和 lacZ的的a肽互补（蓝白斑）相结合肽互补（蓝白斑）相结合2222基因工程载体基因工程载体乳糖操纵子调节机制乳糖操纵子调节机制乳糖操纵子乳糖操纵子(lac operon)(lac operon)的结构的结构β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶2323基因工程载体基因工程载体2424基因工程载体基因工程载体 - -半乳糖苷酶和半乳糖苷酶和XgalXgal的显色反应的显色反应-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），也叫-肽（ lacZ’ ） Xgal是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物；-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体2525基因工程载体基因工程载体大肠杆菌大肠杆菌ββ- -半乳糖基因（半乳糖基因（lacZ’lacZ’基因）基因）------蓝白斑选择原理1、b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝；2、 a-肽，也叫lacZ’ ，是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断，lacZ只有在a-肽形成4聚体的状态下才有功能。

若受体菌lacZ`突变，受体菌本身的b-半乳糖苷酶失效，不能分解Xgal 3、pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成4、IPTG的诱导作用：IPTG是乳糖的类似物能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的受体菌基因组中的lacZlacZ的C端部分和载体的载体的lacZ’lacZ’都表达5 5、、IPTGIPTG诱导的结果：诱导的结果：MCSMCS无插入时，互补，蓝菌斑；无插入时，互补，蓝菌斑；MCSMCS有插入时，不互补，白菌斑有插入时，不互补，白菌斑2626基因工程载体基因工程载体2727基因工程载体基因工程载体无质粒的无质粒的受体菌受体菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；；无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养无菌斑无菌斑生长生长质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被载体产物缺失被载体产物 互补，能分解互补，能分解XgalXgal且有抗菌且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有蓝色菌有蓝色菌斑生长斑生长带外源带外源DNADNA插插入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补 - -半半乳糖苷酶的缺乳糖苷酶的缺失。

不能分解失不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有白色菌有白色菌斑生长斑生长2828基因工程载体基因工程载体1、更小的分子量如、更小的分子量如pUC18为为2682bp，，pUC8为为2750bp2、选择方便选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择显色、抗菌素双重直接选择3、克隆便利具有多克隆位点、克隆便利具有多克隆位点4、测序方便测序方便现在最常用的现在最常用的pUC载体是载体是pUC18，它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的，它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制，在正常情况下，它的拷贝数可达上千个，所以不分子标记，并且是松弛型复制，在正常情况下，它的拷贝数可达上千个，所以不需要用氯霉素进行扩增需要用氯霉素进行扩增pUC系列系列载体的体的优点点2929基因工程载体基因工程载体PCRPCRPCRPCR产物克隆载体产物克隆载体产物克隆载体产物克隆载体-T-T-T-T载体载体载体载体§1 1．．pMDpMD系列载体：系列载体：Takara公司开发的公司开发的一种高效克隆一种高效克隆PCR产物产物 (TA Cloning)的的专用载体。

专用载体§它由它由pUC18载体载体改建而成在改建而成在pUC18载体的多克隆位点处的载体的多克隆位点处的Xba I 和和Sal I识识别位点之间插入了别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用识别位点，用  EcoR V进行酶切反应后，再在两侧进行酶切反应后，再在两侧的的3‘端添加端添加“T”而成pUC18载体载体EcoR V的酶切位点：的酶切位点：3030基因工程载体基因工程载体3131基因工程载体基因工程载体常用的质粒载体常用的质粒载体   穿梭穿梭质粒粒载体体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体制的质粒载体常用的穿梭质粒载体有：常用的穿梭质粒载体有：大肠杆菌大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌-动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体穿梭载体的优点：穿梭载体的优点：①① 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达；利用大肠杆菌进行基因克隆、表达；②② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达；也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达；③③ 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。

可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因3232基因工程载体基因工程载体f1 origin是f1噬菌体基因组DNA的复制区序列，可引导单链DNA复制过程pUC origin是大肠杆菌复制区序列，可引导双链DNA复制过程 2u origin是酵母菌的复制区序列，可引导双链DNA复制过程大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体3333基因工程载体基因工程载体pcDNA™3.1(+)质粒谱图及其用户实验手册讲解质粒谱图及其用户实验手册讲解 Important Information3434基因工程载体基因工程载体Methods OverviewCloning into pcDNA™3.13535基因工程载体基因工程载体Multiple Cloning Site of pcDNA™3.1(+)多克隆位点3636基因工程载体基因工程载体Multiple Cloning Site of pcDNA™3.1(-)3737基因工程载体基因工程载体pcDNA™3.1 Vectors Map3838基因工程载体基因工程载体pcDNA™3.1 Vectors MapFeatures3939基因工程载体基因工程载体常用的质粒载体常用的质粒载体表达表达载体体原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。

原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体1、普通载体元件、普通载体元件复制起始点复制起始点ORI 选择标记选择标记多克隆位点多克隆位点MCS2、大肠杆菌操纵子元件、大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD）） 转录终止信号区转录终止信号区如果在大肠杆菌里表达蛋白，必须把所克隆的如果在大肠杆菌里表达蛋白，必须把所克隆的目的基因置于大肠杆菌的转录目的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制翻译信号控制之下4040基因工程载体基因工程载体1) 特点特点: a. 基因的启动子序列和终止子序列；基因的启动子序列和终止子序列；b. 一般无检测标记基因；一般无检测标记基因；c.  克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；d. 重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）2) 结构结构: a. 转化单元转化单元--宿主细胞转化宿主细胞转化b. 表达单元表达单元--外源基因表达外源基因表达3) 类型类型: ⅠⅠ型：型：转录起始区（调控序列转录起始区（调控序列+启动子）启动子）+ 终止子终止子ⅡⅡ型：型：转录起始区转录起始区+ 翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+ 终止子终止子ⅢⅢ型：型：转录起始区转录起始区 + 翻译起始区翻译起始区 + 信号肽链编码区信号肽链编码区 + 终止子（常称之为表达分泌型载体）终止子（常称之为表达分泌型载体）表达载体（表达载体（expression vector））4141基因工程载体基因工程载体显然，不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。

换言之，被表达的外显然，不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供换言之，被表达的外源基因一旦确定，表达载体的类型也就确定了源基因一旦确定，表达载体的类型也就确定了例子：例子： pET-43和和pPIC9K4) 用途用途:a. 表达外源基因以产生大量外源基因产物表达外源基因以产生大量外源基因产物b. 用于构建用于构建cDNA文库文库5)  注意事项注意事项: a. 启动子来源启动子来源b. 终止子来源终止子来源c. 启动子的启动效率启动子的启动效率d.信号肽来源与结构信号肽来源与结构e. 调控类型调控类型4242基因工程载体基因工程载体1. 质粒稳定遗传必须的两个条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次；）每个世代、每个质粒至少要复制一次；（（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中六、质粒载体的不稳定性六、质粒载体的不稳定性2. 质粒分配方式：质粒分配方式：有主动分配和随机分配两种假说有主动分配和随机分配两种假说1）主动分配天然质粒具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（）主动分配天然质粒具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配的），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。

方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中2）随机分配人工构建的质粒载体缺失了）随机分配人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中区，只能以随机分配方式分到子细胞中一般情况下也能保证质粒的稳定遗传，但在一定条件下会出现质粒丢失的现象一般情况下也能保证质粒的稳定遗传，但在一定条件下会出现质粒丢失的现象4343基因工程载体基因工程载体3. 质粒分离的不稳定性（质粒分离的不稳定性（segregation instability））在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体4. 结构的不稳定性（结构的不稳定性（structural instability））寄主基因组的寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失ISdimer重组4444基因工程载体基因工程载体5. 影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素（（1）新陈代谢负荷：）新陈代谢负荷：a、复制负荷b、转录和翻译负荷使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。

减缓的程度与质减缓的程度与质粒的分子量成正比粒的分子量成正比丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！（（2）质粒载体的拷贝数）质粒载体的拷贝数质粒载体的拷贝数质粒载体的拷贝数是产生无质粒细胞的重要原因差度（variance）：每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大3）寄主菌的重组体系）寄主菌的重组体系含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒二聚体二聚体灾难（dimer catastrophe）：质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控4545基因工程载体基因工程载体第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体一、噬菌体的一般特性一、噬菌体的一般特性噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是菌体侵犯细菌，也可以认为它是菌体侵犯细菌，也可以认为它是菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌病毒（细菌病毒（Bacteriophage））。

它它本身是一种核蛋白，核心是一段本身是一种核蛋白，核心是一段本身是一种核蛋白，核心是一段本身是一种核蛋白，核心是一段DNADNADNADNA，结构上有一个蛋白质外壳和，结构上有一个蛋白质外壳和，结构上有一个蛋白质外壳和，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNADNADNADNA注入细菌内注入细菌内注入细菌内注入细菌内噬菌体的蛋白质外壳内包裹着的噬菌体的蛋白质外壳内包裹着的DNA，，DNA有双链、单链、线性、有双链、单链、线性、环状等结构环状等结构46基因工程载体二、噬菌体的生活周期二、噬菌体的生活周期1. 溶菌周期溶菌周期    烈性噬菌体烈性噬菌体感染细菌后，立即在菌体内复制感染细菌后，立即在菌体内复制DNA和合成外壳蛋白质，重新组装和合成外壳蛋白质，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体2. 溶原周期溶原周期    温和噬菌体温和噬菌体感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体整合到细菌的染色体DNA中中, 这一过程这一过程称为溶源化。

整合到细菌染色体上的噬菌体称为溶源化整合到细菌染色体上的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制复制而复制47基因工程载体48基因工程载体噬噬菌菌斑斑49基因工程载体三、三、λλλλ噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体载体载体λλ噬菌体是线性双链噬菌体是线性双链DNADNA病毒，具有末端互补的病毒，具有末端互补的12nt12nt的的5‘-突起末端（突起末端（5’-GGGCGGCGACCT-3’），该末端称为），该末端称为cos位点，可被位点，可被λ编码的末端酶所识别编码的末端酶所识别感染感染细菌后粘端互补成双链环状全长细菌后粘端互补成双链环状全长48531bp48531bp，含，含5050多个基因多个基因λλ噬菌体基因大致分为噬菌体基因大致分为4 4个区：个区： 编码头、编码头、 尾部蛋白质为结构区，尾部蛋白质为结构区，A A～～J J共共1919个基因组成；重组区为个基因组成；重组区为 attatt（（attachmentattachment）、）、intint（（intagrateintagrate）及）及xisxis（（excissionexcission）等组成；调控区由启动子、终止子等基因组成；）等组成；调控区由启动子、终止子等基因组成；O-O-R R 为裂解区。

为裂解区 结构区结构区重组区重组区调控区调控区裂解区裂解区50基因工程载体λλλλ噬菌体及其组件的应用噬菌体及其组件的应用噬菌体及其组件的应用噬菌体及其组件的应用λλλλ噬菌体可以容纳较大的目的基因例如用置换法可去掉长达噬菌体可以容纳较大的目的基因例如用置换法可去掉长达噬菌体可以容纳较大的目的基因例如用置换法可去掉长达噬菌体可以容纳较大的目的基因例如用置换法可去掉长达20kb20kb20kb20kb的的的的λDNAλDNAλDNAλDNA，换入相应长，换入相应长，换入相应长，换入相应长度的目的基因度的目的基因度的目的基因度的目的基因λCIλCIλCIλCIts857ts857ts857ts857λ噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程诱导的因素很多，实验室常用的是热诱导如分离得到某些λ噬菌体λclts857 ，在低温时（30℃）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解这些λ噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1tsλclts1857可作为组件插入质粒DNA内目的基因插在λclts857下游，重组体的目的基因在42℃表达，30℃不表达这种方法称为热诱导表达热诱导表达，使用的是温敏开关。

温敏开关λPLλPLλPLλPL和和和和 λPRλPRλPRλPRλPL和PR是λ噬菌体上2个主要的启动子，都是启动能力相当强的转录构件把λ启动子连同其附属成分，将pBR322的tetr基因进行替换，成为以λ启动子为组件的质粒 51基因工程载体λ -DNA载体的构建λ噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：1、基因组太大（、基因组太大（49kb）；）；2、、酶酶切切点点太太多多，，它它有有5个个BamH1位位点点（（G↓GATCC）），，6个个BgⅠ位位点点（（A↓GATCT）），，5个个EcoRⅠ位点（位点（G↓AATTC）3 3、野生型只能接纳一定长度的、野生型只能接纳一定长度的DNAλ噬菌体的改造：噬菌体的改造：1 1、、切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；或更大）；2 2、、去掉太多的酶位点，每种酶只留去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口；3 3、增加标记基因；、增加标记基因；4 4、、引入无义突变引入无义突变载体类型：载体类型：1、插入型载体：、插入型载体：通过特定的酶切位点允许外源通过特定的酶切位点允许外源DNA片断插入的载体（片断插入的载体（0-11kb) 。

2、置换型载体：、置换型载体：允许外源允许外源DNA片断替换非必需片断替换非必需DNA片断的载体片断的载体(9-23kb)52基因工程载体λ-DNA载体的选择标记1、、lacZ 基因基因 ：：IPTG/X-gal 2、基因、基因 cⅠⅠ 失活失活 （热敏感）（热敏感）3、、Spi 筛选筛选 ：野生型的：野生型的l噬菌体不能在噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生），这种生长抑制表型受长抑制表型受λ-DNA上的上的red和和gam两个基因控制若将外源两个基因控制若将外源DNA取代取代red和和gam，，重组噬菌体便拥有重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑成透明斑代表性λ噬菌体载体1、插入型载体、插入型载体 -λgt10 载体载体2、置换型载体、置换型载体 -EMBL3 基因 cⅠ被一段来自 434 噬菌体的片段 imm434替换了，其中内有一个 EcoRⅠ 位点 在填充片段两端带有对称的多克隆在填充片段两端带有对称的多克隆位点位点 53基因工程载体四、单链噬菌体载体四、单链噬菌体载体1．． M13 噬菌体的生物学M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染革兰氏阳性大肠杆菌。

感染宿主后不裂解宿噬菌体颗粒是丝状的，只感染革兰氏阳性大肠杆菌感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂M13 噬菌体的基因组为单链噬菌体的基因组为单链 DNA （（+DNA），由），由 6407 的碱基组成基因组的碱基组成基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基较大的间隔位于基因个碱基较大的间隔位于基因 ⅧⅧ 和基因和基因 ⅢⅢ 以及基因以及基因 ⅡⅡ 和基因和基因 ⅣⅣ 之间，其间之间，其间有调节基因表达和有调节基因表达和 DNA 合成的元件合成的元件M13 噬菌体基因组可编码噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白，形态发生蛋白，结构蛋类蛋白质，包括复制蛋白，形态发生蛋白，结构蛋白54基因工程载体M13M13没有包装限制：没有包装限制：2、单链噬菌体的特点：、单链噬菌体的特点：（（1）存在两种类型，）存在两种类型，ssDNA和和RF dsDNA；；（（2））+DNA（（ssDNA）；）；    （（3）复制型（）复制型（RF）是双链环状）是双链环状DNA；；（（4））RF  dsDNA和和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌，并产生噬菌斑；都能转染感受态大肠杆菌，并产生噬菌斑；（（5）不存在包装限制；）不存在包装限制；（（6）可产生大量的含有外源）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。

插入片断的单链分子，便于作探针或测序J. Messing证明，证明，IG区存在区存在M13的复制起点，的复制起点，可以插入外源可以插入外源DNA而不影响而不影响M13噬菌体的噬菌体的活力55基因工程载体M13的生活周期雄性细菌的雄性细菌的F性菌毛性菌毛：：仅见于少数革兰阴性菌，比普通菌毛略微稍粗，一个菌体只仅见于少数革兰阴性菌，比普通菌毛略微稍粗，一个菌体只有有1～～4根，通常由质粒编码带有性菌毛的细菌具有致育能力，称为根，通常由质粒编码带有性菌毛的细菌具有致育能力，称为F+菌或者雄性菌菌或者雄性菌雄性菌的遗传物质能通过性菌毛传递给雄性菌的遗传物质能通过性菌毛传递给F-菌，这个过程称为接合细菌可以通过这个方式菌，这个过程称为接合细菌可以通过这个方式传递耐药性以及毒力此外，性菌毛还是某些噬菌体感染宿主菌的受体传递耐药性以及毒力此外，性菌毛还是某些噬菌体感染宿主菌的受体56基因工程载体3. M13载体的构建载体的构建单链单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其噬菌体在用作载体时是利用其双链双链 RF DNARF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。

作，并可通过转化方法再次导入细胞1）载体的插入位点）载体的插入位点在在 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA基因 ⅡⅡ 和基因和基因 ⅣⅣ 之间的之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点在间隔区是主要的外源片段插入位点在基因基因 ⅧⅧ 和基因和基因 ⅢⅢ 之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦2））M13 噬菌体载体组成噬菌体载体组成现在所使用的现在所使用的 M13 噬菌体载体是噬菌体载体是 Messing 及其同事建立的及其同事建立的 mp 系列载体，以基系列载体，以基因因 ⅡⅡ 和基因和基因 ⅣⅣ 之间的区域作为外源之间的区域作为外源 DNA 插入区mp 载体系列都是从同一个重组载体系列都是从同一个重组 M13 噬菌体噬菌体 （（M13mpl）） 改造而来的在改造而来的。

在 M13mpl 载体中，间隔区内的载体中，间隔区内的 HaeⅢⅢ 位点插入了一小段大肠杆菌位点插入了一小段大肠杆菌 DNA ，引入，引入laz·的的 α 互补筛选互补筛选57基因工程载体3））M13载体系列载体系列①① M13载体系列的命名：载体系列的命名：M13mpn，，n代表系列数字代表系列数字②② 对对M13mp1的改进：加上常用的酶切位点如的改进：加上常用的酶切位点如B. Gronenborn和和J. Messing1978年把年把LacZ’ 5’端的第端的第13个核苷酸个核苷酸G突变成突变成A，产生了一个，产生了一个EcoR I切切点，构建成点，构建成M13mp2③③ 对对M13mp2的进一步改进产生了的进一步改进产生了M13mp系列载体在系列载体在M13mp2的的LacZ’的的5‘端端加上一段人工合成的多克隆位点（加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）如M13mp7、、M13mp8、、M13mp9、、M13mp10、、M13mp11、、M13mp18、、M13mp194））M13mpl8 和和 M13mpl9M13mpl8 和和 M13mpl9 这两个载体含有这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。

片段 M13mpl8 和和 M13mpl9 DNA 的全序的全序列已经测定完成，这两种载体只是在列已经测定完成，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所区内不对称的多克隆区的方向上有所不同M13mpl8 和和 M13mpl9 轻易不能重新环化仅当连接混合液中含有带匹配末端轻易不能重新环化仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链的外源双链 DNA片段时，方可闭合成环这一片段在片段时，方可闭合成环这一片段在 M13mpl8 和和 M13mpl9 中中将以两个互为相反的方向插入这样一来，在将以两个互为相反的方向插入这样一来，在 M13mpl8 重组体的子代噬菌体内重组体的子代噬菌体内含有外源含有外源 DNA 的一条链，的一条链， M13mpl9 重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链故用故用 M13mpl8 和和 M13mpl9 作为一对载体，就可能用一个引物作为一对载体，就可能用一个引物 ，从所插入，从所插入 DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的 DNA 序列，并可制备只与外序列，并可制备只与外源源 DNA 的任意一条链互补的的任意一条链互补的 DNA 探针。

探针58基因工程载体M13mp1M13 RFBsuI不完全消化各种长度的线性片断（其中应有只在IG上切开的线性全长M13）E.coli lac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ’）JM101宿主只有在IG区插入lacZ’才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑59基因工程载体4. M13系列载体的优点：系列载体的优点：（（1）有）有MCS，便于克隆不同的酶切片段便于克隆不同的酶切片段2）） Xgal显色反应，可供直接选择显色反应，可供直接选择3）无包装限制，克隆能力大无包装限制，克隆能力大4）可以克隆双链）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（子代分子中的每一条链（子代M13噬菌体中包含的是单连噬菌体中包含的是单连+DNA）5. M13载体的缺点：载体的缺点：（（1）） 插入外源插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降后，遗传稳定性显著下降2）实际克隆能力小于）实际克隆能力小于1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）虽无包装限制，并非无限包装）60基因工程载体五、五、 COS质粒载体质粒载体cosmid 是英文是英文 cos site-carrying plasmid 的缩写的缩写, 也称粘粒、柯斯载体。

本意是带有粘也称粘粒、柯斯载体本意是带有粘性末端位点的质粒性末端位点的质粒, 因此因此, 柯斯质粒是人工建造的的含有柯斯质粒是人工建造的的含有λDNA的的cos序列和质粒序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体复制子的特殊类型的质粒载体1. 结构特点结构特点：在普通质粒载体中插入一个或两个来自在普通质粒载体中插入一个或两个来自λ的的cos位点片段，双位点片段，双cos载体比单载体比单cos载体易于重组，载体易于重组，cos结构长结构长200 bp，由以下几个亚单位组成：，由以下几个亚单位组成：a. cosN—λ末端酶的末端酶的gpA亚基识别和切割，产生亚基识别和切割，产生5-12 nt突起；突起；b. cosB—分别位于分别位于cosN的两侧，称之为的两侧，称之为cosBL（左侧）和（左侧）和cosBR（右侧），为（右侧），为λ末端酶的结末端酶的结合位点61基因工程载体优点：优点：1、容量大（可达、容量大（可达45 kb），用于基因簇的克隆；），用于基因簇的克隆；2、形成的重组、形成的重组DNA分子可进行体外包装，并能感染分子可进行体外包装，并能感染E.coli细胞（在细胞内不能形成噬菌细胞（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）；体颗粒，因而不能形成噬菌斑）；3、操作简便，可直接转化细胞；、操作简便，可直接转化细胞；4、对重组、对重组DNA分子长度具有选择性包装；分子长度具有选择性包装；遗传标记：与质粒载体相同，利用抗生素抗性选择转化子，例子遗传标记：与质粒载体相同，利用抗生素抗性选择转化子，例子: pJB8和和C2XB 62基因工程载体六、噬菌粒载体（六、噬菌粒载体（phagemid vectors））噬菌粒（噬菌粒（phagemid）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。

此间隔区含噬菌体选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区此间隔区含噬菌体 DNA 合成合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列含噬菌粒的的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列含噬菌粒的细菌被噬菌体感染后，基因细菌被噬菌体感染后，基因 ⅡⅡ 蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生生 ssDNA 并进行包装并进行包装噬菌粒具有以下特征：噬菌粒具有以下特征：①① 双链双链 DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；②② 免却了将外源免却了将外源 DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤；骤； ③③ 由于载体足够小，故可得到长达由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源的外源 DNA 区段的单链；区段的单链；④④两种复制形式：既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点因此，两种复制形式：既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点因此，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。

 噬菌粒的主要优点在于它噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源可以产生大段外源 DNA 的适量单链拷贝，又不必担的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源心发生缺失突变，而这些外源 DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规区段常常由于太大而不能克隆于常规 M13 载体载体但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链 DNA 的产量较低且重复性较差的产量较低且重复性较差63基因工程载体第三节第三节   人工染色体载体人工染色体载体酵母人工染色体酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC)：YAC人工染色体载体是利用酿酒酵人工染色体载体是利用酿酒酵母（母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中酿酒酵母中A.W.Murray 1983年形成年形成YAC构建理论构建理论, D.T.Burke等等1987年变为现实酿年变为现实酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含分钟；含 16 条染色体，每条的大小为条染色体，每条的大小为 225-1900kb；具真核；具真核mRNA 的加工活性。

的加工活性6464基因工程载体基因工程载体（1）DNA复制起始点（ori）（2）着丝粒（centromere，cen）（3）两个端粒（telomeres，tel）染色体复制和遗传的三个基本组件：染色体复制和遗传的三个基本组件：TELTELCENORI6565基因工程载体基因工程载体（1）着丝粒区（CEN）A AGTCACGTG TTGTTTCTGNTTTCCGAAA酵母染色体着丝粒区的保守序列:IIIIII 78-86bp酵母第3、4、6、11号染色体的着丝粒区序列YAC的组成结构的组成结构6666基因工程载体基因工程载体（2）端粒（TEL）两个端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列如人是TTAGGG重复序列; 四膜虫是 GGGTTG重复序列3）复制起点（ORI）约100bp的自主复制序列（ARS）4）克隆位点克隆位点位于 SUP4 基因内部插入外源基因导致SUP4酶失活，酵母菌落呈红色；不失活的菌落是白色5）在酵母中的标记基因TRP1（色氨酸缺陷）、URA3（尿嘧啶缺陷），分别位于两臂6）在细菌中操作细菌的复制起点 ori和抗生素标记Ampr6767基因工程载体基因工程载体（一）（一）YAC人工染色体载体的复制元件人工染色体载体的复制元件（（ 1）两个端粒重复序列（）两个端粒重复序列（telomeric repeat，，TEL）：定位于染色体末端一段序列，用）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构 （（2）着丝粒（）着丝粒（centromere，，CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中在裂过程中能正确分配到子细胞中在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒使用的是酵母第四条染色体的着丝粒3）自主复制序列（）自主复制序列（autonomously replication sequences，，ARS）） 一段特殊的序列，一段特殊的序列，含有酵母菌中含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号进行双向复制所必须的信号二）（二）YAC的特点的特点（（1）只能在酵母细胞中扩增只能在酵母细胞中扩增2）克隆容量大，为）克隆容量大，为230kb-1700kb3）构建原理是按染色体结构构建构建原理是按染色体结构构建6868基因工程载体基因工程载体（三）（三）YACYAC的组成结构的组成结构（（1）着丝粒区（）着丝粒区（CEN）：酵母染色体着丝粒区的保守序列由三个区组成。

酵母染色体着丝粒区的保守序列由三个区组成2）端粒（）端粒（TEL）：两个端粒序列）：两个端粒序列Tel酵母端粒保守序列是酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列人是重复序列人是TTAGGG重复序列重复序列; 四膜虫是四膜虫是 GGGTTG重复序列）重复序列）（（3）自主复制序列（）自主复制序列（ARS）：）： 约约100bp的自主复制序列（的自主复制序列（ARS）真核生物中只有酵）真核生物中只有酵母菌有母菌有ARS））（（4）克隆位点：位于）克隆位点：位于 SUP4 基因内部基因内部5）选择标记：）选择标记：YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因氨酸合成缺陷型基因 trp 1、、 leu 2和和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石等，以及赭石突变抑制基因突变抑制基因 sup4 与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变基因带有一个赭石突变 ade 2-1。

带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，基因的突变效应，形成正常的白色菌落利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源形成正常的白色菌落利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子片段插入的重组子6）在细菌中操作：细菌的复制起点）在细菌中操作：细菌的复制起点 ori和抗生素标记和抗生素标记Amp r 6969基因工程载体基因工程载体（三）（三）YACYAC的组成结构的组成结构（（1）着丝粒区（）着丝粒区（CEN）：酵母染色体着丝粒区的保守序列由三个区组成酵母染色体着丝粒区的保守序列由三个区组成2）端粒（）端粒（TEL）：两个端粒序列）：两个端粒序列Tel酵母端粒保守序列是酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列人是重复序列人是TTAGGG重复序列重复序列; 四膜虫是四膜虫是 GGGTTG重复序列）重复序列）（（3）自主复制序列（）自主复制序列（ARS）：）： 约约100bp的自主复制序列（的自主复制序列（ARS）。

真核生物中只有酵）真核生物中只有酵母菌有母菌有ARS））（（4）克隆位点：位于）克隆位点：位于 SUP4 基因内部基因内部5）选择标记：）选择标记：YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因氨酸合成缺陷型基因 trp 1、、 leu 2和和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石等，以及赭石突变抑制基因突变抑制基因 sup4 与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变基因带有一个赭石突变 ade 2-1带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，基因的突变效应，形成正常的白色菌落利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源形成正常的白色菌落利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。

片段插入的重组子6）在细菌中操作：细菌的复制起点）在细菌中操作：细菌的复制起点 ori和抗生素标记和抗生素标记Amp r 7070基因工程载体基因工程载体（四）（四）YAC克隆外源克隆外源DNA主要是用来构建大片段主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆常规的基因克隆当用内切酶切割当用内切酶切割YAC 载体成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的载体成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒这些元件在酵母菌中可以驱必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的动染色体的复制和分配，决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段对于线形化的微型酵母染色体，当切割抑制基因对于线形化的微型酵母染色体，当切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中，达到克隆大片段菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中，达到克隆大片段DNA 的目的。

的目的装载了外源装载了外源 DNA 片段的重组子导致抑制基因片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活，从而形成红色菌落；插入失活，从而形成红色菌落； 而载而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落这些红色的装载了不同外源这些红色的装载了不同外源 DNA 片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了 YAC 文库 YAC 文库装载的文库装载的 DNA 片段的大小一般可达片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达，有的可达 1Mb 以上，甚至达到以上，甚至达到 2Mb 7171基因工程载体基因工程载体（五）（五）YAC转化过程转化过程（（1）宿主酵母菌：）宿主酵母菌： trp- 和和 ura-如AB13802）选择方式：只有同时）选择方式：只有同时得到得到YAC的两个臂（色氨酸，的两个臂（色氨酸，尿嘧啶），才能在基本培养尿嘧啶），才能在基本培养基（不加基（不加TRP和和URA）上）上生长7272基因工程载体基因工程载体载体类型 存在方式所需DNA序列标记基因 转化频率（菌落/μgDNA）稳定性无丝分裂 有丝分裂 整合型(YIp5) 整合1-几个拷贝与染色体DNA同源 Apr Tcr URA3<10+a+a附加体型(YEp13) 自主复制多拷贝2μ质粒Apr Tcr LEU2103-104 -b-c复制型(YRp7) 自主复制多拷贝ARSApr Tcr TRP1103-104 -b-c着丝粒型(YCp19)染色体状通常单拷贝ARS,CENApr TRP1,URA3103-104+d+d线型(YLp21)染色体状通常单拷贝ARS、CEN、TELTRP1，HIS3103-104+e+酿酒酵母各种人工染色体载体的特征酿酒酵母各种人工染色体载体的特征a. 每次细胞分裂仍有约每次细胞分裂仍有约1%的载体的载体DNA从染色体上脱落下来从染色体上脱落下来b. 在选择培养基中在选择培养基中15-20代后，代后，10-30%的转化子丢失载体的转化子丢失载体DNAc. 非孟德尔式分离，主要是非孟德尔式分离，主要是4+：：0-d. 无丝分裂时有无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离转化体质粒不发生分离在选择培养基上丢失质粒的转化体低于在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1% 1% 7373基因工程载体基因工程载体第四节第四节 动物病毒载体动物病毒载体 •质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。

感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或作基因治疗等74基因工程载体一、反转录病毒载体一、反转录病毒载体•属于正链属于正链RNA病毒，显著的特点是具有病毒，显著的特点是具有2倍体基因组两倍体基因组两个相同的个相同的RNA分子在分子在5’端附近经氢键连接形成端附近经氢键连接形成70S RNA，，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用这种结构可能在逆转录过程中起调节作用75基因工程载体反转录病毒的基因组结构反转录病毒的基因组结构•类似于真核细胞类似于真核细胞mRNA•LTR是长末端重复序列在病毒基因组整合中至关重要整合时，整是长末端重复序列在病毒基因组整合中至关重要整合时，整合酶在合酶在U5-U3连接处切开双链连接处切开双链DNA，随机插入到宿主基因组里随机插入到宿主基因组里。

LTR本身还具有启动子和本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能加尾信号的功能•U5、、U3：：5’段或段或3’端独特序列端独特序列•y+：组装时必需的非编码序列组装时必需的非编码序列 •env：外壳蛋白外壳蛋白 •pol：反转录酶和整合酶反转录酶和整合酶 •gag：核心蛋白核心蛋白76基因工程载体（三）反转录病毒载体构建（三）反转录病毒载体构建（（1）删除）删除pol、、env和和gag基因 （（2）插入标记基因（如）插入标记基因（如neor））（（3）外源基因和启动子插入到）外源基因和启动子插入到y+下游四）反转录病毒载体的包装（四）反转录病毒载体的包装（（1）包装细胞系的构建）包装细胞系的构建    反转录病毒反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞用两个缺失了转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞用两个缺失了y+的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白 （（2）载体）载体RNA的包装的包装    用载体用载体DNA转化包装细胞系转入的载体转化包装细胞系转入的载体DNA上带有上带有y+，转录成的载体，转录成的载体RNA就会被包就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。

装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒 （五）反转录病毒载体的优点（五）反转录病毒载体的优点（（1）将）将DNA插入宿主基因组的随机位点上插入宿主基因组的随机位点上 （（2）侵染范围广、感染率高侵染范围广、感染率高 （（3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定， 拷贝数目较低拷贝数目较低 （（4）包装的外源）包装的外源DNA可达可达10kb （（5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性反转录病毒一般只感染处）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞）在分裂状态的细胞）DNA病毒载体病毒载体—腺病毒载体腺病毒载体（一）腺病毒的基因组：是线状双链（一）腺病毒的基因组：是线状双链DNADNA病毒，基因组中有病毒，基因组中有1414个基因共同特点是都带有个基因共同特点是都带有倒置的末端重复（倒置的末端重复（ITRITR），在病毒的复制过程中起非常重要的作用在病毒的复制过程中起非常重要的作用 （二）腺病毒的优点：（二）腺病毒的优点：（（1 1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用比较安全，无致病、致癌、致畸作用。

（（2 2）宿主范围广：不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞宿主范围广：不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞3 3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染4 4）载体中的插入片断可达）载体中的插入片断可达7.5kb 7.5kb （有包装容量限制）有包装容量限制） （（5 5）腺病毒容易制备、纯化腺病毒容易制备、纯化 （（6 6）基因组结构和功能了解得清楚基因组结构和功能了解得清楚（三）腺病毒载体（三）腺病毒载体目前最常用的基因治疗载体之一目前最常用的基因治疗载体之一腺病毒载体的构建腺病毒载体的构建:用同源重组的方法插入外源基因用同源重组的方法插入外源基因1）删除腺病毒）删除腺病毒DNA一些非必需区如一些非必需区如E1或或E3区，增加插入能力区，增加插入能力2）构建质粒载体含有）构建质粒载体含有E1或或E3区两侧的同源序列，并在同源序列之间插入外源基因和区两侧的同源序列，并在同源序列之间插入外源基因和选择标记基因选择标记基因3）把质粒切成线性）把质粒切成线性（（4）共同转染细胞共同转染细胞。

在细胞中发生同源重组，把外源在细胞中发生同源重组，把外源DNA加到病毒基因组中，并包装成重组病毒颗粒加到病毒基因组中，并包装成重组病毒颗粒 （四）重组腺病毒（四）重组腺病毒DNA在细胞中的生存在细胞中的生存（（1）以游离的附加体形式存在于细胞中不能整合到细胞基因组中基因表达时间短以游离的附加体形式存在于细胞中不能整合到细胞基因组中基因表达时间短2））E1是腺病毒繁殖的必需区缺失是腺病毒繁殖的必需区缺失E1的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的细胞中繁殖感染的细胞中繁殖3））E3区对腺病毒的繁殖不是必需的缺失区对腺病毒的繁殖不是必需的缺失E3的重组腺病毒不需要辅助病毒的重组腺病毒不需要辅助病毒宿主系统宿主系统80基因工程载体•E.coli DH5aE.coli DH5a菌株菌株在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1•E.coli BL21(DE3)E.coli BL21(DE3)菌株菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。

该菌适合表达非毒性蛋白基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3）•E.coli JM109E.coli JM109菌株菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]•E.coli TOP10E.coli TOP10菌株菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)， φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74， recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG基因工程中常用的工程菌基因工程中常用的工程菌81基因工程载体•1、基因重组相关的基因型、基因重组相关的基因型recA(Recombination)表达ATP依赖型DNA重组酶，具有对DNA放射性损伤的修复功能。

Del-recA说明此菌株的表现型是重组缺陷的recB(Recombination)表达ATP依赖型DNase和核酸外切酶V的一个亚基，对recA的DNA重组酶起辅助和促进作用DNase催化双链DNA的解旋和解链，核酸外切酶V催化单链DNA的 裂解，在DNA的重组和损伤修复中发挥重要作用recC(Recombination)表达核酸外切酶V、ATP依赖型的核酸内切酶、解旋酶和ATP酶，它们和recA, recB所表达的酶相互协调作用，在DNA的重组及放射性损伤的修复中发挥作用大肠杆菌基因型及遗传符号说明（1）82基因工程载体•2、甲基化相关的基因型、甲基化相关的基因型dam(DNA adenine methylase)表达DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特异序列GATC中A的甲基化，保证DNA免受限制性核酸内切酶MboI的切断，同时在 DNA复制时也起一定的辅助作用dcm(DNA cytosine methylase)表达DNA胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCWGG序列，并使第二个C甲基化，即CmCWGG,避免DNA受到相关限制酶的切断hsdM表达DNA甲基化酶，该酶是I型限制酶复合体(具有对 DNA切断和修补的双重功能)的一部分，它能使DNA双链上的AA(双腺嘌呤)甲基化，保护宿主DNA不被分解。

大肠杆菌基因型及遗传符号说明（2）83基因工程载体•3、核酸内切酶相关的基因型、核酸内切酶相关的基因型hsdR表达I型限制酶EcoK(K12株)或EcoB(B株)，在大肠杆菌细胞中起到一种”抗体“的作用，对外来的各种DNA有严格的限制hsdS表达的特异性蛋白是I型限制酶EcoK或EcoB复合体中的一部分，它专门负责hsdR酶和hsdM酶对DNA序列的特异识别endA(Endonuclease)表达非特异性核酸内切酶Ⅰ，它能使所有DNA双链解开，在DNA的复制和重组中起重要作用大肠杆菌基因型及遗传符号说明（3）84基因工程载体大肠杆菌宿主的限制和修饰系统（大肠杆菌宿主的限制和修饰系统（hsdR、、hsdM和和hsdS））hsdShsdRhsdM(1)hsdR (Host specificitive defective Restriction) 限制性内切酶 (EcoKI[K12株] 或 EcoBI[B株])  识别特定位点(EcoKI识别5‘...AAC(N)6GTGC序列，EcoBI识别5’...TGA(N)8TGCT序列)并随机切断DNA2)hsdM (Host specificitive defective Methylation)  DNA甲基化酶  识别特定位点并甲基化(3)hsdS  辅助hsdR和hsdMD85基因工程载体•4、停止密码子相关的基因型、停止密码子相关的基因型supE(Suppressor E)表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合，使蛋白质合成停止。

supE基因变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，遇到停止密码子UAG,蛋白质合成仍能继续，并使UAG作为一个密码子编码谷氨酰胺（Glutamine）supF表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合，使蛋白质合成停止supF基因变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，遇到停止密码子UAG,蛋白质合成仍能继续，并使UAG作为一个密码子编码酪氨酸 （Tyrosine）大肠杆菌基因型及遗传符号说明（4）86基因工程载体•5、点突变相关的基因型、点突变相关的基因型mutS(Mutator)表达的蛋白具有识别DNA上错配序列的功能，并能修复其错配序列（GC→AT），防止基因突变mutT特异性地降解dGTP成为单磷酸盐状态的dGMP，DNA合成受到阻碍，防止dGTP插入模板DNA中导致 A-T转换成 G-C,使DNA产生变异dut(dUTPase)表达脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶(dUTPase)，它能水解dUTP成为dUMP,使细胞体内dUTP的浓度维持在较低的水平，防治dUTP造成的A→U的基因突变大肠杆菌基因型及遗传符号说明（5）87基因工程载体•6、抗药性相关的基因型、抗药性相关的基因型 gyrA(Gyrase)表达DNA促旋酶A亚基。

DNA促旋酶在DNA复制时具有使DNA解旋和回旋的作用rpsL(Ribosomal protein small subunit)表达核糖体30S亚基中的S12蛋白质，S12蛋白作用于翻译的开始阶段链霉素(Streptomycin)作用位点就是核糖体30S亚基上的S12蛋白质，正常情况下链霉素与S12蛋白结合使蛋白质的生物合成不能进行，细胞停止生长rpsL基因的变异使链霉素失去结合位点，从而使该基因型的菌株具有了对链霉素的抗性(Strr)Tn5(Transposon)是带有卡那霉素(Kanamycine)抗性基因的转座子，当Tn5转位到大肠杆菌基因组时，能使此菌株获得卡那霉素的抗性(Kan r) Tn10(Transposon)是带有四环素(tetracycline)抗性基因的转座子当Tn10转位至大肠杆菌基因组时，能使此菌株获得四环素的抗性(Tet r)大肠杆菌基因型及遗传符号说明（6）88基因工程载体•7、能量代谢相关的基因型、能量代谢相关的基因型 lacZ(Lactose)是大肠杆菌中lac操纵子的结构基因，表达β-半乳糖苷酶，分解乳糖为半乳糖苷lacZ 基因的变异或缺失将直接导致β-半乳糖苷酶活性缺失。

lacZ M15是表达β-半乳糖苷酶α片断的一段基因，当△M15时，β-半乳糖苷酶没有活性lac操纵子上的结构基因有lacZ(β-半乳糖苷酶)、lacY(透性酶)、lacA(乙酰基转移梅)得以正常表达ara(Arabinose)表达阿拉伯糖代谢所需的各种酶，其中araA表达阿拉伯糖异构酶、araB表达核酮糖激酶、araC表达阻遏蛋白，araD表达L-核酮糖-4-磷酸差向异构酶、araE表达低亲和型L-阿拉伯糖转运蛋白、araF表达L-阿拉伯糖结合蛋白、araG表达高亲和性的L-阿拉伯糖转运蛋白gal(Galactose)表达半乳糖代谢所需的各种酶类及调节蛋白，其中galE表达尿苷二磷酸(UDG)半乳糖-4-差向异构酶、galK表达半乳糖激酶、galP表达半乳糖透性酶、galR表达半乳糖操纵子的阻遏蛋白、galT表达半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、galU表达葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 大肠杆菌基因型及遗传符号说明（7）89基因工程载体•8、氨基酸代谢相关的基因型、氨基酸代谢相关的基因型 thy A(Thymine）表达胸苷酸合成酶，参与胸腺嘧啶的代谢thyA基因的变异可以利用胸腺嘧啶进行菌株筛选。

proA(Proline)表达γ-谷氨酸磷酸还原酶，作用于脯氨酸生物合成的第二步proA基因的变异或缺失，使脯氨酸的生物合成受阻，在用最小培养基培养细胞时需要特别添加脯氨酸 proB(Proline)表达谷氨酸岩-5-磷酸激酶，它能催化三磷酸盐与谷氨酸盐结合形成谷氨酸-5-磷酸盐，是脯氨酸合成的第一步proB基因的变异或缺失，使脯氨酸合成受阻，在用最小培养基培养时需特别添加脯氨酸 thr(Thronine)包含thrA、thrB和thrC三种基因thrA表达天冬氨酸激酶及I-高丝氨酸脱氢酶，thrB表达高丝氨酸激酶，thrC表述苏氨酸合成酶thr 基因的变异使细胞不能合成苏氨酸，用最小培养基培养时需添加苏氨酸大肠杆菌基因型及遗传符号说明（8）90基因工程载体•9、维生素代谢相关的基因型、维生素代谢相关的基因型 bioH(Biotin)表达的蛋白能催化前生物素到生物素的转化，还能对庚二酰CoA有优先的阻害作用bioH基因的变异使细胞不能自身合成生物素，在最小培养基中必须添加生物素，细胞才能正常生长 thi(Thiamin)表达硫胺素，包含有thiA 、thiB 、thiC 、thiD 、thiK 、thiL 等。

thiA表达硫氨素噻唑转运蛋白、thiB表达硫氨素磷酸盐焦磷酸化酶、thiC表达硫氨素嘧啶转运蛋白、thiD表达磷酸甲基化嘧啶激酶、thiK表达硫氨素激酶、thiL表达硫氨素甲磷酸激酶thi的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养基中必须添加硫氨素（VB1），细胞才能正常生长 大肠杆菌基因型及遗传符号说明（9）91基因工程载体•10、蛋白酶相关的基因型、蛋白酶相关的基因型 lon(long form)表达ATP依赖型蛋白分解酶(La)，它对外源的异型蛋白质具有特异性的分解作用lon基因的变异或缺失，使细胞中的这种异型蛋白质分解酶不能得到表达，这对于保持克隆体目的蛋白的稳定是非常有利的 ompT(Outer membrane protein)表达特异性的外膜蛋白分解酶，它特异性地分解与细胞膜结合的含铁肠菌素受体蛋白ompT基因的变异使膜结合性蛋白分解酶活性缺失，有利于融合蛋白的表达 大肠杆菌基因型及遗传符号说明（10）92基因工程载体•11、物质转运结合相关的基因型、物质转运结合相关的基因型 tonA(Transport)和fhuA(Ferric hydroxamateuptake)基因处于基因组图同一位点，它们的作用也相同，都是表达外膜受体蛋白。

这种受体蛋白与铁络合物结合，并与tonB 蛋白相互协调作用，把铁化合物运至细胞质中tonA和fhuA基因的变异使细胞对铁离子的吸收受到阻害，同时使细胞对某些抗菌素及噬菌体更敏感，有利于质粒转化和菌体筛选 tsx(T-six)基因表达T6噬菌体和大肠杆菌素K的受体蛋白，它结合于细胞膜的外表面，对T6噬菌体和大肠杆菌素K进入细胞起关键作用另外tsx受体蛋白还有与核苷酸特异性结合的功能，是核苷酸特异性运输通道的第一步，在核苷酸的吸收方面也起重要作用tsx 基因的变异使外界某些噬菌体及大肠杆菌素等对细胞的侵噬变得困难，有利于细胞基因组的稳定 cysA(Cysteine)基因表达硫酸盐/硫代硫酸盐转移蛋白，参与细胞对硫酸盐的吸收与转运，通过cysA蛋白转运的硫酸盐将参与半胱氨酸的生物合成cysA基因的变异使半胱氨酸的生物合成受到影响，在培养此基因型的菌株时要注意添加半胱氨酸93基因工程载体•12、其他、其他 deoR(Deoxyribose)是大肠杆菌中deo操纵子的调节基因，它表达的阻遏蛋白对deo操纵子具有重要的调控作用deo操纵子含有deoA、deoB、deoC和deoD等结构基因，分别表达DNA代谢所需的酶类，即胸腺嘧啶磷酸化酶、磷酸转位酶、脱氧核糖磷酸醛缩酶和嘌呤核苷磷酸化酶。

deoR基因的变异，使deo操纵子的阻遏蛋白不能表达，宿主细胞合成大量的dCTP，可以选择性地改善大分子DNA的转化 relA(Relaxed)是松弛调节基因，对RNA的合成具有调节抑制作用同时relA基因还表达ATP:GTP3`-焦磷酸转移酶，负责在氨基酸饥饿状态下鸟苷3` ,5`-二磷酸(ppGpp)的合成，以适应饥饿环境 tyrT(Tyrosine)基因专门负责转录酪氨酸tRNA(转运RNA)，tyrT基因的变异使以酪氨酸为主的蛋白质的合成受阻大肠杆菌基因型及遗传符号说明（12）94基因工程载体•DH5α™ ：F–，φ80，lacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，recA1recA1，，endA1endA1，，hsdR17 hsdR17 (rK–, mK+) ，phoA， supE44supE44 ，gyrA96 ，relA1课堂小练习F-：缺失F质粒.Φ80：宿主携带λ-噬菌体φ 80.lacZ ΔM15：删除编码β-半乳糖苷酶的部分lacZ基因(α片断的一段基因).Δ(lacZYA-argF)U169：lacZYA表示lacZ(β-半乳糖苷酶)、lacY(透性酶)、lacA(乙酰基转移梅)，argF基因是精氨酸合成酶，U169表示三个lac基因和argF基因之间缺失了10000bp.hsdR17 (rK–, mK+) ： R17代表特异性识别蛋白发生变异， (rK–, mK+) 表示由于R17的变异而导致 K12株来源的hsdR 功能缺失.phoA：大肠杆菌碱性磷酸酶.gyrA96 ：突变DNA解旋酶95基因工程载体常用于基因工程的宿主菌常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。

菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株如：如： E.coli DH5: F–, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–,λ–,recA1,  relA1,gyrA96 E.coli DH5α: F–, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–,λ–, recA1, relA1,gyrA96; φ80dlacZ△ △M15, △ △(lacZYA-argF)U169            E .coli DH5αF’: F’, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–, λ–, recA1, relA1, gyrA96,φ80dlacZ△ △M15, △ △(lacZYA-argF)U169       i. 三者均有重组基因缺陷，外源三者均有重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组可存活，且不发生重组       ii. DH5α和和 DH5αF’都具有一个可供遗传标记都具有一个可供遗传标记lacZα检测的遗传背景检测的遗传背景       iii. DH5αF’可供可供M13mp系列载体配套使用，系列载体配套使用，M13病毒的感染需要病毒的感染需要 F’的存在。

的存在96基因工程载体•启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性•启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的•TATA框的主要作用是使转录精确地起始；CAAT框和GC框则主要是控制转录起始的频率，特别是CAAT框对转录起始频率的作用更大•Kozak序列和SD序列对于mRNA的翻译起重要作用启动子97基因工程载体启动子可分为诱导型启动子诱导型启动子和组成型启动子组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7, pMC1，PGK启动子等组成型启动子组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异诱导型启动子诱导型启动子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平CMV启动子：启动子：巨细胞病毒的启动子CMV启动子（增强子）被广泛应用于构建高效真核表达载体。

CMV是大家公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子98基因工程载体•终止子(terminator T)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列在一个操纵元中至少在构基因群最后一个基因的后面有一个终止子•终止子位于poly(A)位点下游，长度在数百碱基以内的结构终止子终止子可分为两类：一类不依赖于蛋白质辅因子就能实现终止作用另一类则依赖蛋白辅因子才能实现终止作用这种蛋白质辅因子称为释放因子，通常又称ρ因子 两类终止子有共同的序列特征在转录终止点前有一段回文序列99基因工程载体100基因工程载体。