DGGE操作步骤.doc

变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺1.07gMilliQ（超纯水） 水加到100mL溶液采用0.45µm滤膜过滤，储存在4℃2、0％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL20mL25mL30mL50×TAE缓冲液2mL2mL2mL2mLMilliQ 水83mL78mL73mL68mL总容积100mL100mL100mL100mL3、100％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL20mL25mL30mL50×TAE缓冲液2mL2mL2mL2mL去离子甲酰胺40mL40mL40mL40mL尿素42g42g42g42gMilliQ 水加到100mL加到100mL加到100mL加到100mL4、50×TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g2M冰乙酸57.1 ml1M0．5M EDTA，pH8.0 100.0mL50mMMilliQ 水加到1000.0mL 将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8×固定液（250 ml）：乙醇 200 ml冰乙酸 10mlMilliQ 水 40ml （A）：1×固定液（400 ml）：8×固定液 50mlMilliQ 水 350ml（B）银染溶液(400ml)：AgNO3 0.6gMilliQ 水 300ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH 4.5gMilliQ 水 300 ml 甲醛 0.9ml6、10％过硫酸铵（APS）：过硫酸胺 0.3g超纯水 3.0ml溶解后使用0.45µm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。

7、10ml DGGE加样缓冲液：2％溴酚蓝 0.25ml2％二甲苯青 0.25ml100％甘油 7 mlMilliQ水 2.5ml二、不同引物的变性梯度1,乳杆菌（380bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵35％（12ml）7.8ml4.2ml13ul56ul65％（12ml）4.8ml7.2ml13ul56ul2,双歧杆菌（596bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵40％（12ml）7.2ml4.8ml13ul56ul70％（12ml）3.6ml8.4ml13ul56ul3,肠球菌（300bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵40％（12ml）7.2ml4.8ml13ul56ul55％（12ml）5.4ml6.6ml13ul56ul4,V3 region（217bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵35％（12ml）7.8ml4.2ml13ul56ul65％（12ml）4.2ml7.8ml13ul56ul60％(12ml)4.8ml7.2ml13ul56ul5,V6-V8 region (489bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵42％（12ml）7ml5ml13ul56ul58％（12ml）5ml7ml13ul56ul浓缩胶：0%变性储存液 7ml， TEMED 8ul， 10%过硫酸铵 36ul三、实验操作1．封槽（1）用95 %乙醇擦净清洗一大，一小两块玻璃板，干燥。

2）用95 %乙醇清洗两个间隔条，并将其置于大块玻璃板两侧边缘，外边缘与玻璃板边缘相齐3）将小块玻璃板置于间隔条上，对齐，并用夹子固定这个“sandwich”2．胶的制备用不同体积的两种变性剂和丙烯酰胺贮存液配置变性剂要求浓度的胶经验上讲，胶的体积以刚好覆盖胶板为宜本实验V3区扩增产物DGGE采用65%和35%的变性剂浓度溶液；乳杆菌特异序列扩增产物DGGE采用60%和35%的变性剂浓度溶液配置方法如下：不同引物的变性梯度0％100％总体积0% 7mL0mL7mL35%7.8mL4.2mL12mL40%7.2mL4.8mL12mL50%6.0 mL6.0 mL12 mL60%4.8 mL7.2 mL12 mL65%4.2 mL7.8 mL12 mL(1)清洗梯度合成器并使之干燥，并关掉两个槽之间的活栓2)干燥梯度合成器的槽3)分别向两个浓度的变性剂溶液中加4.5 µL /mL 10% APS(过硫酸铵)和1µL/ mL的TEMED（四甲基乙二胺），搅拌均匀4)把高浓度变性剂溶液加到梯度合成器右边的槽中，低浓度变性剂溶液加到梯度合成器左边槽中5)将连接梯度合成器的出口针头置于胶板之间并固定。

6)推动梯度形成器形成的梯度分离胶即注入两层玻璃板之间在混合和灌胶时应避免产生气泡7)分离胶灌完后，取出针头，将其置于一个锥形瓶中，并停止搅拌8)冲洗梯度合成器的两个槽，打开泵，排出其中水分9)在浓缩胶中加入10% APS和TEMED并将浓缩胶灌入两层的玻璃板之间10)待浓缩胶充满后，在其顶部插入梳子（避免产生气泡），放置1 h3．电泳(1)在电泳槽中添加新配置的电泳缓冲液，打开电泳仪预热到60 ℃2)取掉梳子，用蒸馏水清洗没有凝聚的胶,并将sandwich固定在电泳槽内3)调节缓冲液的高度，使其刚刚超过胶上的加样孔4)用缓冲液清洗加样孔（注射器及针头）5)向胶顶部的加样孔中加入PCR的产物6)盖上电泳仪的盖子，打开开关，电泳 220 v，10 min， 随后85 v ,16 h4．染色(1)电泳完成后将胶取出置于一个干净的不锈钢或塑料容器中，水洗3次2)加入400 mL 1×固定液，摇3 min3)将固定液倒入在容器中（后面操作使用）4)添加200 mL银染溶液在摇床上摇20 min5)弃去银染溶液，用蒸馏水轻洗胶3次及容器6)添加新鲜蒸馏水 摇1-2 min7)弃去蒸馏水，添加少量显影溶液，摇一会儿，直至出现清晰条带为止。

8)弃去显影溶液，加入使用过的1×固定液，摇5 min9)弃去固定液10)加入蒸馏水摇2 min,后弃去蒸馏水11)取出胶并置于一个洁净的玻璃板上，干燥，照相5．注意事项：(1)DGGE电泳中使用有高毒性和致癌的一些试剂，故在实验过程中应注意加强自身的保护，如带手套等2)灌胶的时候避免产生气泡3)银染溶液不能随便放弃，以避免造成环境污染，应回收进行统一处理4)染液和显色液不能直接倒在胶上，防止染色显色不均匀过硫酸铵（APS）的作用主要是提供自由基，然后在促凝剂TEMED的作用下使丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚合TEMED四甲基乙二胺: 用于配制PAGE胶等可以催化过硫酸铵产生自由基,从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。