细菌质粒的接合转移ppt课件.ppt

实验四实验四 细菌质粒的接合转移细菌质粒的接合转移 李晓华李晓华 程国军程国军一：目的要求一：目的要求了解在自然条件下微生物遗传信息传送的方式；掌握细菌质粒转移的原理和流程 二：根本原理二：根本原理•在质粒转移过程中，供体菌与受体菌在质粒转移过程中，供体菌与受体菌细胞经过结协作用严密接触，质粒从细胞经过结协作用严密接触，质粒从供体细胞向受体转移，同时进展质粒供体细胞向受体转移，同时进展质粒复制，这就是结合转移的过程按能复制，这就是结合转移的过程按能否自主转移，将天然存在的质粒分为否自主转移，将天然存在的质粒分为两大类 •1．．转移型移型质粒：多粒：多为低拷低拷贝的大的大质粒，含有完好粒，含有完好的的转移支配子基因〔移支配子基因〔tra〕和〕和转移起始位点能在同移起始位点能在同种或种或亲缘关系近的菌体关系近的菌体细胞胞间进展展转移例如：移例如：• 大大肠杆菌：杆菌：F因子、因子、R1、、R100、、R6K、、RP4……• 天天蓝色色链霉菌：致育性因子霉菌：致育性因子pSCP1、、pSCP2……•2．非．非转移型移型质粒：多粒：多为高拷高拷贝的小的小质粒，如大粒，如大肠杆菌的杆菌的ColE1、、RSF1010等。

由于短少等由于短少转移基因〔移基因〔tra〕，不能自主〕，不能自主转移，但由于含有与移，但由于含有与F质粒粒类似的似的bom〔或〔或nic〕位点或〕位点或诱动基因基因mob〔〔mobilization〕，因此能被〕，因此能被带有有tra基因的基因的转移性移性质粒粒诱动而而发生生转移 转移子的挑选转移子的挑选•挑选培育基为：根本培育基挑选培育基为：根本培育基+抗生素；抗生素；• • 供体和辅助大肠杆菌均营养缺陷型，不能供体和辅助大肠杆菌均营养缺陷型，不能在根本培育基上生长；在根本培育基上生长；• 未转化胜利的受体菌不能在有抗生素的未转化胜利的受体菌不能在有抗生素的平板上生长平板上生长三：实验菌株三：实验菌株•供体菌：供体菌：E.coli DH5α(pTR102) (TcR)，含有，含有 mob基因基因 ；；•受体菌受体菌: 紫云英根瘤菌紫云英根瘤菌 ( TcS) ；；•辅助菌助菌: E. coli MM294 (pPK2073)〔〔SpeR〕，含有〕，含有tra基因 四：实验内容四：实验内容 •预备•将受体、供体、将受体、供体、辅助菌分助菌分别培育到培育到对数期：数期：• 供体菌：供体菌：E.coli DH5α(pTR102) (TcR)，，LB + Tc 20μg /ml，，37℃℃震震荡培育培育1夜；夜；• 受体菌受体菌: Sinorhizobium fredii ( TcS)，， TY, 28℃℃震震荡培育培育2天；天；• 辅助菌助菌: E. coli MM294 (pPK2073)〔〔SpeR〕，〕，LB + Spe 50 μg/ml 37℃℃震震荡培育培育1夜夜•用可用可调定量移液器汲取供体、定量移液器汲取供体、辅助菌各助菌各 0.4ml，，吸受体菌吸受体菌0.6ml，都参与同一，都参与同一eppdorf管内〔每个管内〔每个同窗做同窗做1管〕，放入离心机内，管〕，放入离心机内，10000转/min 离离心心1分分钟。

•倒上清，向沉淀加倒上清，向沉淀加 1ml 的的 TY液体，用液体，用 tip上下抽上下抽吸，洗吸，洗涤菌体，再菌体，再10000转/min离心离心1分分钟，倒上，倒上清，留清，留100μl左右用于左右用于悬浮菌体•倒倒TY平板，然后用平板，然后用镊子取子取灭菌菌滤纸片片贴于已于已预备好的好的TY平板上〔每平板上〔每2个同窗个同窗1片，片，2-3片片/平板〕用用200μl的的 tip 抽吸抽吸eppdorf管内沉淀的菌体，打管内沉淀的菌体，打散成散成浓菌液，将之加到菌液，将之加到滤纸片中央〔切勿片中央〔切勿倾斜平斜平板，以免菌液流出板，以免菌液流出滤纸片以外〕片以外〕,吹干•28℃℃培育培育2天 操作步骤〔第一天〕操作步骤〔第一天〕 倒倒SM平板平板•将根本培育基〔将根本培育基〔SM〕溶化，加千分之一的〕溶化，加千分之一的维生素混合液，然后加相生素混合液，然后加相应量的四量的四环素〔素〔15U/ml〕，每〕，每2人人1皿•另另预备1瓶根本培育基，不加抗生素，用于瓶根本培育基，不加抗生素，用于对照•将倒好的平板用将倒好的平板用报纸包好后放入包好后放入4℃℃冰箱，冰箱，备用〔注：四用〔注：四环素在素在强光下易分解〕光下易分解〕•向向灭菌青霉素瓶中加菌青霉素瓶中加3ml无菌水，将已培育无菌水，将已培育的的TY平板上的平板上的滤纸片用无菌片用无菌镊子放入水中，子放入水中，在震在震荡混匀器上洗菌体，充分打散。

混匀器上洗菌体，充分打散•向向1ml的的ep管加管加 0.9mL无菌水，取无菌水，取0.1ml菌菌液，混匀液，混匀 汲取汲取 200μL涂皿•少数同窗另取稀少数同窗另取稀释液，涂液，涂1板不加板不加Tc的的SM做做对照照 •平板放平板放28 ℃℃培育培育4-6天后看天后看结果操作步骤〔第三天〕操作步骤〔第三天〕 五：实验报告内容五：实验报告内容转移频率转移频率=SM+Tc平板的单菌落数平板的单菌落数/纯纯SM平板平板的单菌落数的单菌落数 SM+Tc平板的单菌落数为：平板的单菌落数为：纯纯SM平板的单菌落数为：平板的单菌落数为：六：思索题六：思索题•他以为本次实验方法适宜哪些方面的研讨他以为本次实验方法适宜哪些方面的研讨任务？任务？。