宝宝乐口服液对瘦素调节VMN神经元膜电位的影响药学论文.doc

宝宝乐口服液对瘦素调节VMN神经元膜电位的影响_药学论文 整理 作者：杜永平 张月萍 郭姣 孙亚娟 杜兰芳 张国成【摘要】 目的 研究宝宝乐口服液对瘦素调节下丘脑腹内侧核(VMH)神经元膜电位的影响方法 利用红外可视脑片膜片钳技术记录对照组、厌食组和 治疗 组三组模型动物VMN神经元的膜电位，分析瘦素及宝宝乐口服液对VMN神经元膜电位的影响结果 瘦素使三组动物大部分神经元去极化，各组间比较差异无显著性少数VMN神经元在瘦素作用下超极化，各组间比较差异亦无显著性但模型组VMN神经元的膜电位被瘦素去极化而导致自发放电增加的细胞比例增多，被瘦素超极化而自发放电减少的细胞比例减少，对瘦素无反应的细胞比例也减少；而治疗组去极化、超极化和无反应的细胞数与对照组差异无显著性结论 宝宝乐口服液能够通过影响降低VMN对瘦素的整体敏感性，使VMN发出适度的饱信号，从而恢复正常的食欲和摄食量 【关键词】 宝宝乐口服液 下丘脑腹内侧核 膜电位 膜片钳小儿厌食是常见的摄食行为异常，发生率约为12%～34%，对儿童生长发育影响较大，对小儿厌食发生 发展 及其特效疗法的深入研究将有助于推动人类对摄食生理调控机制的进一步认识和提高儿童健康水平［1］。

近20年来，国内学者广泛使用以恢复脾胃运转之机，使脾胃调和、脾运复健为主要目的的运脾法为治则，治疗小儿厌食取得很好疗效，并系统研究了运脾法对消化吸收功能的影响，在外周水平上证实运脾法对胃肠道的运动和分泌有显著的调节作用［2］在以往的研究中，我们采用病因模拟法成功制作了幼龄大鼠厌食模型［3］，并就运脾复方对该模型中枢和外周胃肠激素的调节作用［4］、对厌食大鼠下丘脑腹内侧核（ventromedial hypothalamic nuclui，VMN）神经元外周摄食负反馈信息的敏感性的影响进行了研究，取得了一些成果［5］为进一步探讨小儿厌食症的发病机制和运脾复方的作用机制，观察了运脾复方宝宝乐口服液对瘦素调节VMN神经元膜电位的影响　　1 材料与方法 　　1.1 动物及分组　　日龄35～40 d的SD大鼠45只，平均体质量(60±10)g（第四军医大学实验动物中心提供），合格证号SCXK（军）200707随机分为对照组、模型组和治疗组，每组15只所有动物均单笼饲养，自由进食水　　1.2 模型制备和药物治疗 　　按 文献 方法［3］ 制做厌食大鼠模型即用正常鼠饲料喂养对照组大鼠，用特制饲料喂养模型组和治疗组大鼠。

1周后特制饲料喂养的大鼠日摄食量下降30%以上，体质量下降15%以上，表明模型制备成功从实验第8天开始，治疗组大鼠用运脾复方宝宝乐口服液（第四军医大学科西京 医院 药剂科提供，药物组成：苍术、焦山楂、黄芪、党参、陈皮各10 g,白芍、决明子、煅龙骨、煅牡蛎各20 g）灌胃，每日1次，剂量为3.76 g/100 g(为临床2倍等效量)，同时给予对照组和模型组大鼠等容积生理盐水灌胃，连续3周　　1.3 膜片钳记录 　　大鼠腹腔注射10%(φ)水合氯醛（0.33 mL/100 g），麻醉后断头取脑，迅速置于冰水混合的细胞外液（NaCl 126，KCl 2.5，Na2HPO4 1.2， NaHCO3 24，Glucose 11.1，MgSO4 1.2，CaCl2 2.4，单位mmol·L-1，pH7.2～7.4，渗透压浓度299 mOsm）中充氧（95%O2和5%CO2，下同）1 min，移至振动切片机（机槽内注满持续充氧的冰水细胞外液）做200 μm厚的横切面脑片，置入28 ℃持续充氧的细胞外液中孵育1 h，然后在正置纤维镜（Axoskop I；ZEiss，Thornwood，NY）水浸镜头下进行可视膜片钳记录，膜片钳放大器使用MultiClamp 700B（Axon Instruments，美国）。

pClamp8软件（Axon Instrument，Foster City，CA）用来记录和分析数据　　　　全细胞记录（whole cell patch）使用的电极内液成分(单位:mmol·L-1)为：Kgluconate132.3，NaCl 4，CaCl2 0.5，Hepes 10，EGTA 5，ATPMg 4，GTPNa 0.5，Phosphocretin 10，pH 7.2～7.3，渗透压280 mOsm，充灌电极后的电极电阻为6～8 MΩ电极尖端与细胞膜形成高阻封接（达1～10 GΩ），然后吸破细胞膜，在电流钳gapfree状态下持续记录膜电位，观察瘦素（Leptin，50 nmol·L-1）对VMN神经元膜电位的影响，取给药前5 min的基础膜电位与给药最后1min的膜电位进行比较　　所有的化学试剂和药理试剂均购自Sigma公司　　1.4 统计学处理 　　　　实验数据采用均数±标准差(±s) 表示,采用t检验和χ2检验,以P<0.05为差异有显著性　　2 结果 　　　　在对照组（n=15）、模型组（n=16）和治疗组（n=14）大鼠脑片上观察了瘦素对VMN神经元膜电位的影响。

瘦素使大部分神经元去极化（如图1A示），膜电位改变为：对照组（5.01±1.23）mV（n=8），模型组（4.94±0.76）mV（n=13），治疗组（4.99±0.83）mV（n=6），各组间比较差异无显著性少数VMN神经元在瘦素作用下超极化（如图1B示），膜电位改变为：对照组（4.16±0.72）mV（n=3），模型组4.85 mV（n=1），治疗组（3.88±0.94）mV（n=3），各组间比较差异亦无显著性然而，模型组VMN神经元的膜电位被瘦素去激化而导致自发放电增加的细胞比例增多，被瘦素超极化而自发放电减少的细胞比例减少，对瘦素无反应的细胞比例也减少这些结果与瘦素对VMN神经元mIPSC的影响一致，进一步表明瘦素使模型大鼠VMN神经元的兴奋性增强而治疗组去极化、超极化和无反应的细胞数与对照组差异无显著性（图1C），提示宝宝乐口服液能降低瘦素对模型大鼠VMN神经元的去极化作用　　与对照组比较:*P<0.05　　A示瘦素使一个VMN神经元去极化，自发放电显著增加，停止灌流瘦素后膜电位未恢复；B示瘦素使另一个VMN神经元超极化，自发放电消失，停止灌流瘦素后膜电位基本恢复C示三组大鼠VMN被灌流瘦素去极化、超极化和无反应的神经元构成比。

　　图1 瘦素对三组大鼠VMN神经元膜电位的影响（略）　　Figure 1 Effects of leptin on membrane potential of VMN neurons　　3 讨论 　　　　目前，厌食已经成为儿科临床的常见疾病之一，对儿童的生长发育影响较大，发病机制尚不明确，西医至今仍未发现特效的疗法国外流行病学调查提示，婴儿和学龄前儿童进食问题（包括拒食和偏食）的发生率约为12%～34％， 治疗 多以合理喂养和心理引导为主［6］国内研究集中在消化功能紊乱、微量元素缺乏和免疫功能低下等方面，取得了一些成果［1,2］中医药治疗本病有独特的优势，其中运脾法［7］经过20多年大量的临床观察，证实该法在治疗小儿厌食症方面有着可靠的疗效 　　　　近年来，我们采用病因模拟法成功建立了幼龄大鼠厌食模型［3］，发现该模型下丘脑和外周CCK 等多种与摄食控制相关的脑肠肽水平异常［4］，食欲中枢——下丘脑外侧区和下丘脑腹内侧区神经元自发放电频率改变［5］；临床治疗小儿厌食有可靠疗效的运脾复方不仅可调节外周血中摄食相关肽类激素水平,而且能调节下丘脑食欲中枢神经元的自发放电频率［4,5］提示该造模因素可能使VMN发出过度的饱信号，从而引起动物摄食量下降，运脾复方能降低单个神经元的自发放电频率，从而抑制VMN发出的饱信号。

　　　　VMN是摄食控制环路中的一个重要核团，刺激VMN终止动物摄食，而毁损VMN导致动物过食而肥胖，因此VMN被称为饱中枢［8］瘦素是由脂肪细胞释放入血液的一种激素，直接作用于下丘脑神经元参与摄食调节，瘦素水平升高抑制摄食行为，瘦素水平降低刺激摄食行为［9］据此，推测厌食大鼠VMN神经元兴奋性的改变及运脾复方的调节作用可能与瘦素的影响有关　　　　研究表明［10］，膜电位的变化直接影响神经元动作电位的发放本研究结果显示，瘦素对VMN神经元膜电位的影响存在3种情况——去极化、超极化和无反应去极化的VMN神经元比例在模型组显著增加，超级化的VMN神经元在模型组显著减少，表现出对瘦素的敏感性增强模型组VMN神经元对瘦素的敏感性并不表现在单个神经元对瘦素反应的强烈程度上，如膜电位去极化的幅度，而是表现为瘦素引起去极化的细胞数量的增加，同时使相反反应和无反应的细胞数减少，似乎是VMN神经元群对瘦素反应的不同模式在模型组进行了重新组合而治疗组VMN神经元对瘦素的不同反应的比例恢复正常这说明大鼠VMN神经元对瘦素的不同反应存在着合理的比例关系，虽然大部分神经元在瘦素作用下电活动变得活跃起来，但却有一小部分神经元的电活动反而被抑制了，即使是那部分对瘦素无反应的神经元也具有潜在的调节功能。

也许正是由于后两种情况的存在，才能使VMN灵活机动地发放饱信息，而本实验造模因素和中药复方正是通过对这一比例关系的改变而影响动物的摄食量因此笔者认为宝宝乐口服液能够通过影响降低VMN对瘦素的整体敏感性，使VMN发出适度的饱信号，从而恢复正常的食欲和摄食量 参考 文献 】 　　［1］ 张月萍,杜永平,汪受传,等. 小儿厌食发生 发展 及运脾法作用中枢机制研究的新思路［J］. 中国 中医基础医学杂志，1998，4(4)：18.　　［2］ 汪受传,尤汝娣,郁晓维, 等. 运脾方药治疗小儿厌食症的临床及实验研究［J］. 中西医结合杂志, 1991,11 (2) :75-78.　　［3］ 杜永平,张月萍,汪受传,等. 小儿厌食症动物模型的再研究［J］.山西医科大学学报, 2000, 31 (5):401－402.　　［4］ DU Y P, ZHANG Y P, WANG S C, et al. Function and regulation of cholecystokinin, betaendorphin and gastrin in anorexic infantile rats treated with ErBao Granules［J］. WJG, 2001,7 (2)：275-280.　　［5］ 杜永平,张月萍,张国成.儿宝颗粒对厌食大鼠下丘脑外侧区神经元整合摄食相关信息的影响［J］. 中国中西医结合杂志，2005，25（11）：996-999.　　［6］ 金明星 编译.婴儿和学龄前儿童进食问题的原因和治疗［J］.国外医学:妇幼保健分册，1995,6（3）：106.　　［7］ 万历生,汪受传.中医药治疗小儿厌食症的现状与展望［J］.南京中医药大学学报,2000,16（1）：63-64.　　［8］ 张月萍，王建军. 摄食控制的神经体液机制研究进展［J］. 中国神经 科学 杂志, 2001, 17(4): 350-353.　　［9］ ABHIRAM S. Leptin signaling in the hypothalamus: emphasis on energy homeostasis and leptin resistance［J］. Frontiers in Neuroendocrinology, 2004, 24:225-253.　　［10］ CHEN Q, PAN H L. Regulation of synaptic input to hypothalamic presympathetic neurons by GABAB receptors［J］. Neuroscie。