非创伤性股骨头坏死患者血浆来源微泡的代谢组学研究.docx

    非创伤性股骨头坏死患者血浆来源微泡的代谢组学研究    罗鹏 郑远 葛海峰[Summary] 目的 采用液相色譜-质谱联用技术的代谢组学方法，探讨非创伤性股骨头坏死（NONFH）患者血浆来源微泡的生物标志物，为NONFH的诊断提供依据 方法 选取2020年5—11月温州医科大学附属第二医院收治的20例NONFH患者及配对的20名健康体检者的血浆样本，分离微泡，并采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱法分析微泡中代谢物，结合主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘分辨分析法（OPLS-DA）筛选差异性代谢产物结果 样本中共鉴定出12种差异性代谢产物，其中肌苷、次黄嘌呤、尿酸及花生四烯酸上调（P<0.05）;半胱氨酸、同型半胱氨酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S）和硫酸孕烯醇酮下调（P<0.05） 结论 采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱法分析NONFH血浆来源微泡的代谢产物是可行的，为NONFH的筛查提供新的参考依据[Key] 股骨头坏死;微泡;代谢组学;创伤[] R681.8          [] A          [] 1673-9701（2021）35-0032-05Metabonomics study of plasma-derived microvesicles in patients with non-traumatic necrosis of the femoral headLUO Peng1   ZHENG Yuan2   GE Haifeng31.Department of Orthopedics，the Second Affiliated Hospital and  Children′s Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou   325000，China; 2.The Second School of Medicine of Wenzhou Medical University， Wenzhou   325000， China; 3.Department of Laboratory Medicine，the Second Affiliated Hospital and Children′s Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou   325000，China[Abstract] Objective To explore the biomarkers of plasma-derived microvesicles from patients with non-traumatic necrosis of the femoral head （NONFH） by using the metabonomics method of liquid chromatography-mass spectrometry， and to provide a basis for the diagnosis of NONFH. Methods A total of 20 patients with NONFH and 20 matched healthy subjects who were admitted to the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University From May to November 2020 were selected. The microbubbles were separated. The metabolites in microvesicles were analyzed using ultra-high performance liquid chromatography tandem time of flight mass spectrometry. The differential metabolites were screened combined with principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares resolution analysis （OPLS-DA）. Results A total of 12 different metabolites were identified in the sample， of which inosine，hypoxanthine，uric acid and arachidonic acid were up-regulated （P<0.05）;cysteine，homocysteine，pyruvate，malic acid，α-ketoglutarate， dehydroepiandrosterone sulfate （DHEA-S） and pregnenolone sulfate were down-regulated（P<0.05）. Conclusion It is feasible to analyze the metabolites of NONFH plasma-derived microbubbles by ultra-high performance liquid chromatography tandem time-of-flight mass spectrometry，which provides a new reference basis for NONFH screening.[Key words] Femoral head necrosis; Microvesicles; Metabolomics; Trauma非創伤性股骨头坏死（Non traumatic osteonecrosis of the femoral head，NONFH）常与长期、大剂量或不规范使用糖皮质激素、大量酗酒等有关，约占股骨头坏死总数的70%～80%[1]。

现有的多种影像学方法虽使得NONFH的早期诊断率得以提升，但各类影像学方法仍存在缺陷，使得该病的早期诊断依旧困难重重微泡（Microvesicles，MVs）是一组由多种细胞在生理和病理状态下释放的，直径在100～1000 nm之间的异质性膜囊泡[2]近年来，随着研究的深入，人们逐渐认识到微泡在疾病诊断、预后及个性化治疗方面具有广阔的医学应用前景[3]本研究采用代谢组学的方法对健康人群及非创伤性股骨头坏死患者血浆来源的微泡进行分析，找寻差异性代谢产物，筛选出潜在的生物标记物，为疾病的诊断提供新的依据，现报道如下1 资料与方法1.1 一般资料选取2020年5—11月在温州医科大学附属第二医院诊治的NONFH患者（NONFH组）和按年龄、性别及身高配对的健康体检者（对照组），每组各20例，血样分别由本院骨科和体检中心提供，所有参与者均同意并签署研究方案的知情同意书本研究已经我院医学伦理委员会审核通过NONFH组患者的纳入标准：①参照国际骨循环研究会（Asociation research circulation osseous，ARCO）诊断标准[4-5]，经X线和磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）确诊为NONFH，且ARCO分期为Ⅲ或Ⅳ级;②年龄30～70岁。

NONFH组患者的排除标准：①有髋部外伤及手术史者;②有代谢性骨病的病史，包括严重的骨质疏松症、骨肿瘤，伴有骨转移的恶性肿瘤、甲状旁腺功能亢进或甲减、Paget病或肾性骨营养不良等;③不同意参加该研究项目者健康体检者的纳入标准：①相同时间段就诊的体检者;②年龄30～70岁;③体检未发现基础性疾病者;④同意参加该项目者1.2 仪器与试剂仪器：高速冷冻离心机（型号5810R）购于德国Eppendorf公司;JEM-1200EX电子显微镜购于日本JEOL公司;Nanosight 300系统购于英国Malvern Panalytical公司;Waters Xevo G2XS Q-TOF，色谱柱Acquity UPLC HSS T3 column （Waters，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）及数据分析软件Progensis QI均购于上海沃特世公司;CD63、TSGl01抗体、PBS（Phosphate-buffered saline）、PBST（Phosphate-buffered saline with Tween 20）、RIPA（Radioimmunoprecipitation assay buffer）裂解液均购于美国Thermo Fisher Scientific公司;甲醇、乙腈、甲酸、氯仿均购于上海Sigma试剂公司、超纯水仪购于上海Milli-Q公司。

1.3 血浆标本采集及储存采集血液前一晚禁食（22：00开始），次日早晨8时（早餐前）从NONFH组患者和对照组受试者获得血液样品，将血液标本置于5000×g离心机下离心20 min，取上清（血浆），装入新的离心管，并置于-80℃冰箱中储存以免代谢物衰减1.4 微泡的分离为了最大程度地减少溶剂提取之前血浆样本中代谢物成分的变化，将所有冻融血浆样本在室温下于冰上融化25 min随后将样品置于离心管中，在4℃下以17 000×g离心90 min，弃上清，将沉淀物用PBS重悬，再次以17 000×g离心90 min（4℃）分离出MVs1.5 微泡的鉴定1.5.1 透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）  取重悬于PBS中的MVs 20 μL滴置在Formvar—碳涂层的网格（200孔）上吸附10 min，风干后，使用2%磷钨酸溶液染色2 min后，采用JEM-1200EX电子显微镜在60 kV电压下检查样品1.5.2 Nanosight Tracking  通过使用配备有快速视频捕获和粒子跟踪软件的Nanosight 300系统测量布朗运动来确定分离制剂中存在颗粒的粒径分布。

所有样品采集后设置均保持相同，并对每个视频进行分析以给出均值和中位数值来表示囊泡大小及颗粒浓度的估算值1.5.3 Western blot  用RIPA缓冲液裂解MVs，并进行超声混匀然后，在10% SDS-PAGE上分离蛋白，并使其转到PVDF（Polyvinylidene fluoride）膜上在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h后，PBST稀释的一抗CD63（1∶1 000）、TSGl01（1∶500）在4℃下孵育过夜;用PBST洗涤3次后，将膜与相应二抗在室温下孵育2 h，用增强的化学发光试剂Western Pico将免疫反应蛋白条带可视化，然后在电泳凝胶成像分析系统上成像1.6 代谢物提取将微泡重悬于100 μL水中，2次冻融后超声裂解并保存在冰上每个样本加入100 μL预冷的水及267 μL预冷甲醇，涡旋震荡1 min随后在4℃下以13 000×g离心10 min，吸取全部上清移至新的EP管中，加入533 μL氯仿，涡旋震荡10 s相同条件下再次离心5 min，吸取350 μL上层溶液至新的EP管中，氮气吹干，加入100 μL 50∶50 甲醇水复溶，涡旋震荡10 s，通过0.45 μM滤膜过滤，转移至色谱瓶，准备进样。

1.7 液质联用分析方法1.7.1 色谱条件  色谱柱：Acquity UPLC HSS T3 column（Waters，2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液;洗脱程序：0 min：1% B，1 min：1% B。