实验十血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳.ppt

实验十 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳1 实验目的⑴ 了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素 薄膜电泳操作技术； ⑵ 掌握测定人血清中各种蛋白质的相对百 分含量；2 实验原理Ø醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物它是 纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成Ø它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微 孔薄膜，厚度约0.1-0.15mm为宜太厚吸水性差，分 离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎 Ø本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋 白Ø血清中含有清蛋白，α-球蛋白、β-球蛋白、γ -球蛋白和各种脂蛋白等各种蛋白质由于氨基 酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同 ，在电场中迁移速度不同分子量小、等电点低 、在相同碱性PH值缓冲体系中，带负荷电荷多的 蛋白质颗粒在电场中迁移速度快Ø例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清 在PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显 示5条区带清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、 α2-、β-及γ-球蛋白（如图3-5）图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及 γ-球蛋白，6为点样原点 Ø这些区带经洗脱后可用分光光度法定量 ，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区 带吸收峰及相对百分比。

Ø此法由于操作简单，快速，分辨率高及 重复性好等优点它不仅可用于分离血 清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋 白及同工酶的分离测定3 实验器材与试剂3 实验器 材与试剂 ⑴ 器材⑴ 器材电泳仪及电泳槽（包括直流电源整流器和电泳槽两个 部分，电泳槽用有机玻璃或塑料等制成，它有两个电 极，用白金丝制成醋酸纤维素薄膜（2×8cm） ；培养皿（直径9-10cm）；解剖镊子竹夹子；点样器 ；直尺和铅笔；玻璃板（12×12cm）；试管若干及试 管架；吸量管（2mL，5mL）；可见光分光光度计；吹 风机；单面刀片；普通滤纸及臭氧化缸（可用普通容 器代替）⑵ 试 剂⑵ 试剂 ① 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6, 0.07mol/L, 离子强度 0.06)Ø称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于 三角烧瓶中，加蒸馏水约600mL，稍加热溶解，冷却后用 蒸馏水定容至1000mL置40C保存，备用 ② 血清蛋白染色Ø染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸 馏水40mL，甲醇（AR）50mL，冰乙酸（AR）10mL，混匀 溶解后置具寒试剂瓶内贮存Ø漂洗液：取95%乙醇（AR）45mL，冰乙酸（AR）5mL和蒸 馏水50mL，混匀置具塞试剂瓶中贮存。

③透明液：临用前配制Ø甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，混 匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用Ø乙液：取冰乙酸（AR）25mL，无水乙醇（AR）75mL，混 匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用④保存液：液体石蜡⑤定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：Ø称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至 1000ml4 实验方法与步骤4 实验方法 与步骤 ⑴ 仪器与 薄膜的准备⑴ 仪器与薄膜的准备① 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择Ø用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿 中，若漂浮于液面的薄膜在15-30s内迅速润湿，整条薄 膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿 缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚 薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果Ø将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约 30min后，方可用于电泳 ② 电泳槽的准备Ø根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条Ø在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽 的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与 支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内当滤纸条全部 润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡 ，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。

Ø滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称 为滤纸桥 ③ 电极槽的平衡Ø用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电 极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15- 20min注意，取出平衡装置时应将活塞关紧⑵ 点样⑵ 点样Ø取一张干净滤纸（10×10cm），在距纸边1.5cm处用铅笔划 一平行线，此线为点样标志区Ø用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的 缓冲液无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模 板底边对齐点样区距阴极端1.5cm处点样时，先用玻璃 棒或血色素吸管取2-3µL血清，均匀涂在加样器上，再将点 样器轻轻印在点样区内，如图3-6所示，使血清完全渗透至 薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线Ø此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点 样技术后再正式点样图3-6 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（ 虚线处为点样位置）⑶ 电泳⑶ 电泳Ø用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥 上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上，如图3-7 所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂如一 电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。

盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10minØ用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接 ，注意不要接错在室温下电泳，打开电源开关，用电泳 仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA（8片薄 膜则为4.8mA）通电10-15min后，将电流调节到每厘米膜 宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50-80min 电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源图3-7 电泳装置剖视示意图 1.纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板⑷ 染色与漂 洗（血清蛋 白染色与漂 洗脱色）⑷ 染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）Ø用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑 10B染色液的培养皿中，浸染5min，取出后再用漂 洗液浸洗脱色，每隔10min换漂洗液一次，连续 数次，直至背景蓝色脱尽Ø取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干 图 3-8 血清蛋白与脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 图谱比较示意图 a.蛋白染色 b.脂蛋白染色⑸ 透明⑸ 透明Ø将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙 液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不 能有气泡，约2-3min薄膜完全透明。

Ø若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次， 垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无酸味Ø再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用 单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用 滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min， 再用滤纸吸干液体石蜡，压平Ø此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描长期保 存不褪色⑹ 结果 判断与 定量⑹ 结果判断与定量Ø一般血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示5条区 带，其排列顺序见图3-8a，未经透明处理的电 泳图谱可直接用于定量测定Ø可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组 分相对百分含量本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫 描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进 行定量下面为后者的具体操作步骤：取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4N氢氧化钠 4ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均 大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动 ，使蓝色洗出约半小时后，用分光光度计进行比色， 波长用650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白 蛋白A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。

光密度总和T＝A+α1＋α2＋β＋γ 各部分蛋白质的分数为：A（清蛋白）% = A / T×100α1-球蛋白 % = α1 / T×100α2-球蛋白 % =α2 / T×100β-球蛋白 % = β / T×100γ-球蛋白 % =γ / T×100 附：迁移率是胶体颗粒的一个物理常数，可用来鉴定蛋白质 等物质以及研究它们的某些理化性质．现将人血浆蛋白质 的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考蛋白质名称等电点泳动脉/(cm2·V-1·S- 1)分子量清蛋白4.88-5.9×10-569000α1-球蛋白 5.06-5.1×10-5200000α2-球蛋白5.06-4.1×10-5300000β-球蛋白5.12-2.8×10-59000-150000γ-球蛋白6.85-7.50 -1.0×10-5156000-300000纤维蛋白元5.40-3.1×10-5正常值：白蛋白57～72% α1球蛋白2～5％α2球蛋白4～9％ β球蛋白6.5～12％ γ球蛋白12～20％表3-12 人血浆蛋白质的等电及迁移率备注备注： ①醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白的正常结果不同于纸上 电泳，主要是白蛋白偏高，个别正常人白蛋白仅超过70 ％。

Α-，α-，和β，γ都偏低，个别正常人γ球蛋臼 可低到12％左右上述正常值仅供参考 ②经电泳，染色之干燥膜浸于冰醋酸：95％乙醇（2:8） 溶液中20分钟，取出后将薄膜平贴于玻璃板上干燥过 程中，薄膜渐变透明此透明薄膜可用扫描光密度计绘 出电泳曲线，并可根据曲线的面积计算各组分的百分数 目前国内已有自动定量的光密度计生产此透明薄膜 可长期保存，供教学示教用5 注意事项5 注意事项 ⑴ 醋酸纤维 素薄膜的预 处理⑴ 醋酸纤维素薄膜的预处理Ø薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一将干膜片 漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度 ，如漂浮15-30s时，膜片吸水不均匀，则有白色斑点或条 纹，这提示膜片厚薄不均，应弃去不用，以免造成电泳后 区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复Ø点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓 冲液太多引起样品扩散但也不能吸得太干，太干则样品 不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影 响分离效果吸水量以不干不湿为宜为防止指纹污染， 取膜时，应戴指套或用夹子⑵ 缓冲液的 选择⑵ 缓冲液的选择Ø醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥缓冲液，其浓度 为0.05-0.09mol/L。

选择何种浓度与样品及薄膜的厚薄有 关在选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间 的膜长度为8-10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为 0.4-0.5mA/cm膜宽Ø当电泳时达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或 进行稀释缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于 扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分 布过于集中，不易分辨⑶加样 量⑶加样量Ø加样品量的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手 段灵敏度密切相关作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量 则越少，对分离更有利如加样量过大，则电泳后区带分离不 清楚，甚至互相干扰，染色也较费时 Ø如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品10.-5μL ，相当于5-1000μg的蛋白，血清蛋白常规电泳分离时，每厘 米加样线加样量不超过1μL，相当于60—80μg的蛋白质但 糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些对每种样品加样量 均应先作预实验加以选择Ø点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时， 动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而 影响电泳区带分离效果⑷ 电量的 选择⑷ 电量的选择Ø电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强 度为0.4-0.5mA/cm宽膜为宜。

Ø电流强度高，则热效应高，尤其在温度较高的 环境中，可引起蛋白变性或由于热效应引起缓 冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜 片干涸电流过低，则样品泳动速度慢且易扩 散⑸ 染色液 的选择⑸ 染。