研究生植物组织培养.doc

第一章 植物组织培养的应用植物组织培养可应用于以下几个方面：1．挽救濒于灭绝的植物；2．快速繁殖稀有植物或有较大经济价值的植物；3、生产脱毒苗；4、利用组织培养的材料作为植物生物反应器；多种中草药资源匮乏,产量不足,甚至濒于灭绝利用组织和细胞培养的方法在实验室生产；可不再依附于自然环境,不仅可以解决现有困难,而且可以通过筛选高产有效成分的细胞系,来提高其药用价值如用培养的人参悬浮细胞来生产人参皂苷利用培养的植物细胞和组织作为生物反应器,也可生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等5、组织培养结合超低温可经济有效地保存植物种质资源 6、组织培养是转基因技术不可或缺的组成部分；7、作物育种〔1〕单倍体育种：采用花药培养可缩短杂合体纯化所需的时间,节省土地,假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同,通过花药培养,在理论上只要有2n个F1代花粉植株,就有可能得到一个所需要的基因组合,而传统育种方法,则至少要有4n个F1植株才能得到一个所需要的基因组合〔2〕在远缘杂交中,通过离体授粉或原生质体融合有可能克服受精前障碍,通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍,通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。

〔3〕通过细胞培养,在细胞水平上进行突变体选择,可在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化,从而提高选择效率,节省时间和土地面积 〔4〕体细胞无性系变异是除有性杂交和理化诱变之外的第三个变异来源 8、用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子,为稀有和珍贵物种的繁殖提供了一种高效的手段9、用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、胚胎学、基因工程、植物发育等的基础研究10、试管花第二章 植物组织培养的发展简史一、 探索阶段<20世纪初至20世纪30年代中>20世纪初,德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可不断分割,直至分到单个细胞的观点,并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力Haberlandt首次进行了离体细胞培养的实验,在1902年发表的"植物离体细胞培养实验"报告中,提出了胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法等科学的预见 1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚,并使这些胚在离体条件下长到成熟Laibach<1925,1929>把由亚麻种间杂交形成的不能成活的胚剖出,在人工培养基上培养至成熟,从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；1922年,美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功。

1934年,White成功离体培养了番茄的根尖二、 奠基阶段<20世纪30年代中至50年代末> 1、White〔1934年〕在番茄根培养实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖他后来<1937>用3种B族维生素〔吡哆醇、硫胺素和烟酸〕,取代酵母浸出液获得成功认识了B族维生素对植物生长的重要意义2、Gautheret<1934>在山毛柳等形成层组织的培养中发现,虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中,这些组织可以不断增殖几个月,但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后,形成层组织的生长才能显著增加1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功同年,White由烟草种间杂种的瘤组织,Nobecourt由胡萝卜,也建立了类似的连续生长的组织培养物因此,Gautheret、White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人3、Skoog<1944>以及Skoog和澂等<1951>发现,腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长,而且还能解除培养基中生长素对芽形成的抑制作用,诱导芽的形成,从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。

4、1952年,Morel和Martin首次证实,通过茎尖离体培养,可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株 5、1953-1954年,Muir进行单细胞培养获得初步成功把万寿菊和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中,放在摇床上振荡,形成了由单细胞和细胞聚集体组成的细胞悬浮液Muir等还用机械方法由细胞悬浮液和容易散碎的愈伤组织中分离得到单细胞,把它们置于一铺在愈伤组织上面的滤纸上培养,使细胞发生了分裂 6、1955年,Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素,并把它定名为激动素7、1957年,Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念,指出在烟草髓组织培养中,根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数8、1958年,Steward等以胡萝卜为材料,首次通过实验证实了Haberlandt关于细胞全能性的设想,成为了植物组织培养研究历史中的一个里程碑9、1958-1959年,Reinert和Steward分别报道,在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚 三、迅速发展阶段<20世纪60年代至现在>1、基础研究： 1965年,Vasil和Hildebrandt用一种化学成分确定的培养基,由分隔培养的烟草单细胞获得了完整的再生植株,进一步证实了植物细胞的全能性 。

2、原生质体培养取得重大突破：1960年Cocking等用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功1971年,Takebe等首次获得了烟草原生质体再生植株1972年,Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合,获得了第一个体细胞杂种3、花药培养取得显著成绩：1964年,Guha和Maheshwari报道,在毛曼陀罗过离体花药培养由小孢子直接发育成胚 1967年,Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株4、微繁技术得到广泛应用1960年,Morel建立了一个离体无性繁殖兰花的方法,繁殖系数极高由于这一方法有巨大的实用价值,很快被兰花生产者所采用,迅速建立起"兰花工业" 第三章 植物组织培养有关的基本概念一、植物细胞全能性细胞全能性:指一个活的植物细胞,只要有完整的膜系统和细胞核,它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础,在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成一个完整植株从理论上讲,只要是一个活的细胞,都有再生出一个完整植株的潜力,但实际情况并非如此简单就目前所知,细胞的再生潜力与其分化程度呈负相关,就是说细胞分化程度越高其再生能力越低,所以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的实验材料。

二、细胞分化、脱分化与再分化细胞分化——分生性细胞在形态结构和功能上发生永久性<不可逆转性>适度变化的过程脱分化——由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂,形成无分化的细胞团〔即愈伤组织〕的过程再分化——由无分化的愈伤组织细胞再转变成为具有一定结构,执行一定生理功能的细胞团和组织,构成一个完整的植物体或植物器官的过程三、器官发生器官发生——由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽<或根>,再在另一种培养基上产生根<或芽>,形成一个完整植株第四章 植物组织培养所需的基本设备与条件一个理想的植物组织培养室应包括：1、化学药品室；2、培养基配制室；3、灭菌室；4、接种室；5、培养室；6、培养物的检测和观察记录室一、化学药品室应配置几个药品橱、实验台、万分之一和百分之一的电子天平室还应放一台大容量的冰箱,用来分门别类地保存激素、抗生素和各种需低温保存的物品组织培养所需主要药品的存放要求如下： 1、可室温存放的药品：无机物、蔗糖、 盐酸、氢氧化钠,95％酒精,琼脂2、宜于零上低温存放的化学药品: 有机物、激素3、应当在一20℃下保存的药品： 液体抗生素等二、培养基配制室需要大于40m2的一个房间或更大些,为了方便起见可将房间分为两个区:一是玻璃器皿的清洗、消毒、干燥区：二是培养基配制区：应有大型实验台若干个,还应配备常温冰箱一台,电炉<1000W,2000W>,微波炉,放置移液管、微量移液器的架子,酸度计等。

三、灭 菌 室灭菌室面积可小一些,其除放灭菌锅外,最好还有临时存放培养基、培养器皿的架子,也应有自来水装置灭菌室可根据灭菌锅的多少,工作量大小来确定面积,要求房间能有较好的通风散热条件,且要配备专门的电源线路,因为电热灭菌锅的耗电量很大四、接 种 室接种室是对培养的植物材料进行无菌操作的地方,应有超净工作台、放置培养容器的架子等整个房间最好设有缓冲间和双层门窗,以防灰尘和微生物房间最好装有紫外灯或经常喷洒杀菌剂,以抑制过多微生物生长工作人员在进入接种室之前在缓冲间更换衣服、鞋帽、穿好工作服,戴上口罩、防尘帽,换上拖鞋才能进入接种区,进入接种区之后随手把活动门关上五、培养室培养室最重要的是要恒温、恒湿,无尘且空气流通温度应维持在<25±3>℃,相对湿度应在50％～60%培养室有规律地安放培养架或摇床培养室所有光照和黑暗应由定时器自动控制整个培养室还应装有一个或多个紫外灯,以便能定时对整个房间进行杀菌处理,特别是在夏天潮湿、霉雨季节,最好每天在晚上用紫外灯杀菌30 min以上培养室的地面、墙壁、培养架及所有器物的表面都应经常清洗、擦拭以防过多灰尘和微生物滋生六、培养物的检测与观察记录室对培养物进行及时的检测和观察记录是研究植物组织培养的重成部分之一,如不及时观察记录或对培养物的形态、结构、生理变化以及培养基变化等进行及时检测,就不可能获得准确有效一手资料,也就不能及时地发现和找出问题,提出解决问题的方法和改进培养的方案。

检测与观察记录室最好单独设立一个房里面摆放实体解剖镜、普通光学显微镜、显微照相和记录设备 第五章 植物组织培养常用培养基成分及培养基配制目前所使用的培养基有10余种之多,大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的例如,White培养基是Uspenski和Uspenskaia<1925>的藻类培养基演化的结果,被广泛用于根的培养；Gautheret培养基是建立在Knop营养液<1865>基础上的以后的培养基大部分是在White和Gautheret培养基的基础上改进而成一、培养基的成分〔一〕、无机营养成分<包括大量元素,微量元素和铁盐>1、大量元素：一般指在培养基中的浓度大于O.5mmol／L的元素氮：常以硝态氮或氨态氮,或两者相互配合的形式存在缺氮时愈伤组织会出现花色素苷的颜色,愈伤组织部不能形成导管 磷：常以NaH2P04·H2O、KH2P04或H2P04的形式提供钾：常以KCl、KN03或KH2P04形式钙：常以CaCl2·2H2O、Ca2镁：常以MgS04·7H2O的形式,既提供了镁也提供了硫缺硫时培养的植物组织会明显的退绿；缺磷或钾时细胞会过度生长,愈伤组织表现出极其蓬松状态。

2．微量元素：指小于O.5mmol／L的元素 主要包括铁、锰、铜、锌、氯、硼和钼等 铁作为一种微量元素,对植物也是必需的,但由于Fe的特殊性质,即很不稳定、易沉淀,需要在酸性条件下才能比较稳定,故在培养基配制时常常把Fe盐单独配制,且常以螯合物的形式,把FeS04和它的螯合剂乙二胺四乙酸钠先分别配成溶液,再相互混合使形成螯合铁,以防止沉淀和帮助被植物吸收〔二〕、有机营养成分维生素: 除维生素B1、维生素B6、烟酸之外,在部分培养基中还添加维生素C<抗坏血酸>、维生素H<生物素>等甘氨酸<氨基乙酸>和肌醇<环己六醇>:肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导另外,在。