壳聚糖_海藻酸钙微胶囊制备工艺对地衣芽胞杆菌生长的影响.pdf

研究报告2009年第 35卷第 11期 (总第 263期 )51 壳聚糖 /海藻酸钙微胶囊制备工艺对地衣芽胞杆菌生长的影响刘博1, 薛伟明1, 张宏亮2, 赵彬然1, 朱敏莉1, 薛美辰11(西北大学化工学院, 陕西 西安, 710069) 2(中国石化集团洛阳石油化工工程公司, 河南 洛阳, 471003)摘 要 针对地衣芽孢杆菌微囊化发酵生产生物药物杆菌肽的研究背景, 以壳聚糖、 海藻酸钠为微载体制备材料, 地衣芽孢杆菌为细胞模型, 采用脉冲电场液滴工艺制备载细胞壳聚糖 /海藻酸钙微胶囊 (AC微胶囊 ), 系统考察了壳聚糖分子量与浓度、 固定化载体类型、 微胶囊粒径和接种密度等工艺条件对微囊化地衣芽孢杆菌培养特性的影响结果表明: 与海藻酸钙凝胶珠相比, AC微胶囊表面囊膜具有良好的物质选择性透过作用, 地衣芽孢杆菌在微胶囊内正常生长且未从囊中泄漏, 在 72h培养过程中微胶囊形态完整; 培养系统组分在微胶囊中传递速率与微胶囊粒径成反比, 固定化细胞的相对生长量随微胶囊粒径减小而增大; 在 211@ 106个 /mL的初始接种密度条件下, 培养过程中微胶囊形态最佳; 固定化细胞达到最大生长量所需时间与壳聚糖分子量成反比, 其中, 10万分子量壳聚糖样品所需时间为 9 h, 并在随后 72 h培养过程中保持稳定生长。

关键词 壳聚糖, 海藻酸钠, 微胶囊, 地衣芽胞杆菌第一作者: 硕士研究生 (薛伟明教授为通讯作者 ) 陕西省教育厅专项科研计划资助项目 ( 07JK386); 西北大学研究生创新基金资助项目 ( 07YZZ23 , 08YZZ49); 陕西省/ 131150科技创新工程重大科技专项 ( 2008ZDKG- 58); 陕西省重点学 科建设项目收稿日期: 2009- 04- 13 , 改回日期: 2009- 08- 25地衣芽孢杆菌的代谢产物杆菌肽是含有噻唑环的多肽复合体, 分子式为 C66H103N17O16S , 是重要的生物药物之一杆菌肽通过抑制细菌细胞壁合成、 结合敏感菌细胞膜等途径对金黄色葡萄球菌、 溶血性链球 菌等多种 G+病原菌以及部分 G-菌具有强烈抑制作用由于杆菌肽刺激性小, 过敏反应少, 常用以治疗敏感菌引起的感染杆菌肽还是很好的促生长类药 物饲料添加剂, 可以增强动物的抵抗能力目前, 国内厂商均采用传统发酵法生产, 但发酵液中的杆菌肽效价低, 这已成为杆菌肽高质高产面临的重要挑战[ 1- 5]生物微胶囊技术是解决上述问题的理想方案之一将细胞包封在由一层半透膜包被的微胶囊中, 利用囊膜的选择扩散作用, 既能使囊内细胞获得外界培养基中营养成分, 又能使代谢产物在浓度梯度作用下 向囊外扩散, 减轻代谢产物对细胞生长的抑制, 促进囊内细胞高密度生长, 增加发酵液中代谢产物含量[ 6- 11]。

TomasZhang首次提出了采用海藻酸钠与壳聚糖制备微胶囊的方法, 在此技术基础上, 国内外学者开发了多种将细胞包封在这种微胶囊中的工艺,包括乳化、 静电络合法、 膜 -乳化法等[ 12- 13]本课题组采用脉冲电场静电液滴凝胶工艺制备海藻酸盐 -壳聚糖 ( Alginate -Chitosan ,AC)微胶囊, 具有生物相容性优良、 价格低廉、 工艺简便温和、 制备效率高的特 点[ 14- 15]以大肠杆菌、 酿酒酵母为细胞模型的固定化和微囊化培养的研究已经取得了一些成果[ 16- 17]本文将 AC微胶囊体系引入地衣芽胞杆菌的固定化培养, 考察了载体类型、 微胶囊粒径、 初始接种密度、 壳聚糖分子量等制备条件对囊内细胞生长特性的影响规律, 以论证 AC微胶囊固定化培养地衣芽孢杆菌 的可行性, 为该体系在固定化地衣芽孢杆菌发酵生产杆菌肽等领域的应用奠定理论与实践基础1 材料与方法111 材料与仪器 11111 菌种和材料地衣芽胞杆菌 (Bacillus licheniform is) (陕西省微 生物研究所 ); 海藻酸钠 (西安市化学试剂采购站, 化学纯 ); 壳聚糖 (浙江金壳生物化学有限公司, 医用 级 ); 其他试剂均为国产分析纯试剂。

11112 仪器 生物微胶囊制备仪 (自制 ), WZ-50C2型注射泵,浙江大学医学仪器有限公司; XDS -1B型倒置生物显 微镜, 重庆光电仪器总公司; 722型可见光光栅分光光度计, 上海精密科学仪器有限公司; T itramate 20型自动滴定仪, 梅特勒 - 托利多仪器 (上海 )有限公司; S HA-B数显气浴恒温振荡器, 江苏金坛市宏华仪器厂 112 实验方法11211 微囊化地衣芽胞杆菌的制备食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION I NDUSTRIES52 2009 Vol135 No111 ( Tot a l263)将对数生长期的地衣芽孢杆菌悬液 10 mL 于6 000 r/m in离心 10 m in , 收集菌体, 与 4 mL、 20 g/L海藻酸钠水溶液混合, 此时混合液中菌体浓度为114 @ 106个 /mL采用微胶囊制备仪将混合液滴入20 g/L CaCl2水溶液中固化 15m in , 制得载细胞海藻酸钙凝胶珠用 1 % (v /v)醋酸溶液配制平均分子量5万、 2 g /L壳聚糖溶液, 使载细胞凝胶珠与壳聚糖 溶液按体积比 1B10混合, 反应 15 m in后得到表面具有半透膜的载细胞壳聚糖 /海藻酸钙微胶囊。

实验均在无菌条件下操作11212 细胞培养 游离培养: 取适量地衣芽孢杆菌种子液加入装有100 mL培养基的 250 mL 锥形瓶中, 37e 、 200 r/m in摇床培养 微囊化培养: 将制备好的载细胞 AC微胶囊转至装有 100 mL 培养基的 250 mL 锥形瓶中, 37e 、 200r/m in摇床培养控制微囊化培养与游离培养实验条件相同, 使二者具有可比性 微囊化批次培养: 过滤收集培养至稳定期的载细胞微胶囊, 转接到装有等量新鲜培养基的锥形瓶中,37e 、 200 r/m in摇床继续培养地衣芽胞杆菌摇瓶培养基配方: 蛋白胨 10 g , 牛 肉膏 3 g , NaCl 5 g, MnSO401005 g, H2O 1 000 mL,p H 710 11213 载细胞微胶囊形态观察在微囊化细胞培养过程中, 间隔一定时间采集微胶囊样品, 在倒置显微镜下观察微胶囊形态和囊内细 胞生长情况11214 细胞生物量的测定对于游离细胞培养样品, 间隔一定时间采集培养 液, 在 722分光光度计上于 650 n m 测其光密度, 利用光密度 (OD )-细胞浓度 ( c)标准曲线计算细胞生物量。

对微囊化细胞培养, 取样后破囊[ 14]使囊内细胞释放, 在 650 nm测定溶液光密度, 计算细胞生物量 光密度 (OD )-细胞浓度 ( c)标准曲线为: OD650=01035 19c菌浓- 01050 3 , 线性相关系数 019977 2 结果与讨论211 地衣芽胞杆菌在壳聚糖 /海藻酸钙微胶囊内的生长状态图 1为载地衣芽胞杆菌壳聚糖 /海藻酸钙微胶囊 在初次培养过程中的形态照片图 1 -a为新鲜制备的载细胞微胶囊, 囊中细胞数量微少, 微胶囊为透明凝胶微球; 培养 8h时, 细胞在囊内生长并形成菌丝形态, 如图 1 -b ; 培养 23 h时, 细胞在囊内生长量进一步 增加, 细胞密度增大, 如图 1-c 图 1 初次培养过程中载地衣芽胞杆菌的壳聚糖 /海藻酸钙微胶囊形态图 2为批次培养条件下的载细胞微胶囊形态将初次培养至稳定期的微胶囊 (图 2 -a) 转接入新鲜培养基后, 细胞适应新环境并重新达到生长稳定期,囊内细胞密度进一步增大 (图 2 -b)图 2 批次培养稳定期时载地衣芽孢杆菌的壳聚糖 /海藻酸钙微胶囊形态研究报告2009年第 35卷第 11期 (总第 263期 )53 结果表明, 采用本文工艺不但实现了地衣芽孢杆菌在壳聚糖 /海藻酸盐微胶囊中的包封, 而且在初次培养及批次培养过程中, 细胞能够在囊内不断生长。

值得一提的是, 尽管囊内细胞密度不断增大, 但微胶 囊形态始终保持完整, 表明壳聚糖 /海藻酸盐微胶囊具有良好的机械弹性和强度, 在长时间连续发酵培养过程中不会导致细胞泄漏, 是细胞固定化培养的理想 载体212 微胶囊膜对微囊化细胞生长特性的影响试验工艺采用 2步法制备载细胞微胶囊: 首先制备载细胞的海藻酸钙凝胶珠, 再使其与壳聚糖溶液反 应, 在凝胶珠表面形成半透性致密薄膜, 得到壳聚糖 /海藻酸钙微胶囊图 3为载细胞海藻酸钙凝胶珠在培养 72 h时的 状态, 结果表明, 凝胶珠在培养过程中形态发生破裂,细胞从胶珠中扩散释放至培养液中, 导致细胞固定化培养失败这是由于海藻酸盐为 p H 响应型水凝胶,当培养基 pH \ 612 时, 海藻酸盐分子中糖单元的 5- COOH解离形成 5- COO-, 分子内及分子间静电斥力增大, 导致凝胶珠结构解聚图 3 载地衣芽孢杆菌的海藻酸钙凝胶珠形态为了防止载体解聚, 利用海藻酸钙分子糖单元5- COO-与壳聚糖分子糖单元 2- NH3+静电反应特 性, 可以在凝胶珠表面形成一层致密的半透性薄膜,该薄膜允许培养基中小分子营养源及细胞代谢产物经膜扩散传递, 同时将细胞控制在囊内生长繁殖, 消除了细胞泄漏现象。

如图 4所示, 与凝胶珠载体培养样品相比, 细胞在具有表面囊膜的壳聚糖 /海藻酸盐 微胶囊中生长更加稳定, 细胞生长量更高图 4 载体类型对固定化地衣芽胞杆菌生长量的影响213 微胶囊粒径对微囊化细胞生长特性的影响本课题组采用 3000Lm和 300Lm 两组不同粒径微胶囊为载体, 考察了微胶囊粒径对固定化地衣芽孢 杆菌细胞生长的影响, 结果如图 5所示结果表明,无论初次培养过程 (图 5- a)还是二次培养过程 (图5- b), 微囊化地衣芽孢杆菌在小粒径微胶囊中的生长量均优于大粒径载体这是由于: ¹ 小粒径微胶囊 的传质路径短, 扩散阻力小, 外界营养物质 (如葡萄糖、 氨基酸、 无机盐、 氧 )能以较快速率扩散至囊内细胞生长位点, 为细胞提供充分营养同时, 囊内细胞 的代谢产物亦能快速向囊外扩散, 有效减轻了代谢产物对细胞生长的抑制作用; º在固定化细胞培养系统中, 小粒径微胶囊的传质比表面积较大, 有利于物质的跨膜传递扩散; »小粒径微胶囊的个体质量小, 易 于在培养系统中稳定悬浮并有效进行物质传递, 同时减轻了体系的搅拌机械负荷因此, 减小微胶囊粒径有利于微囊化细胞的生长图 5 微胶囊粒径对微囊化地衣芽孢杆菌生长量的影响 ( a : 初次培养; b: 批次培养 )214 壳聚糖分子量对微囊化细胞生长特性的影响壳聚糖分子质量是影响壳聚糖 /海藻酸钙微胶囊食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION I NDUSTRIES54 2009 Vol135 No111 ( Tot a l263)表面半透膜性能的重要因素。

课题组选取平均分子质量为 2万、 5万和 10万的壳聚糖制备微囊膜, 并测定了微囊中地衣芽孢杆菌的生长曲线, 结果如图 6所示结果表明, 10万分子质量壳聚糖样品中细胞达 到最大生长量所需时间 9 h , 5万分子量样品所需时间 20 h , 而 2万分子质量样品所需时间为 36 h, 即壳聚糖分子质量与囊内细胞达到最大生长量所需时间 成反比, 并且 3种样品中细胞最大生长量相近图 6 壳聚糖分子质量对微囊化地衣芽孢杆菌生长特性的影响当壳聚糖与海藻酸钙凝胶珠反应时间相同时, 壳聚糖分子质量决定了反应生成的微囊膜厚度与致密程度由于低分子质量壳聚糖分子链较短, 易于向海 藻酸钙凝胶三维网络中径向渗透并与海藻酸盐 5-COO-交联反应, 形成厚且致密的微囊膜, 囊内、 外物 质跨膜传质阻力大, 固定化细胞生长速度较慢随着壳聚糖分子量适度增大及分子链增长, 壳聚糖分子向海藻酸钙凝胶珠中渗透阻力增大, 。