植物激素的测定方法.ppt

植物激素的酶连免疫分析法植物激素的酶连免疫分析法DNM-9602GDNM-9602G酶标分析仪酶标分析仪DNM-9602 DNM-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪 DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪几种酶标分析仪几种酶标分析仪操操 作作 步步 骤骤包被包被------温育温育------洗涤洗涤------竞争竞争------温育温育------洗涤洗涤------加二抗加二抗------温育温育----- -洗涤洗涤------显色显色------比色比色------计算计算包包 被被•每小孔中加入每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后包被缓冲液，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内•37 ℃下小时洗洗 板板将反应液甩干并在报纸上拍净第一将反应液甩干并在报纸上拍净第一次加入洗涤液后要立即甩掉然后再接着次加入洗涤液后要立即甩掉然后再接着加第加第2次共洗涤次共洗涤3次竞竞 争争Ø即加标准物、待测样和抗体即加标准物、待测样和抗体Ø加标样及待测样：加标样及待测样： 取适量所给标样稀释配成：取适量所给标样稀释配成： ABAABA标准曲线的最大浓度为标准曲线的最大浓度为100ng/ml,100ng/ml,然后再依次然后再依次2 2倍稀释倍稀释8 8个浓度（包括个浓度（包括2 2个个0ng/ml0ng/ml，加入前两行的最后两排，加入前两行的最后两排 ）。

将系列标准样加入）将系列标准样加入9696孔酶标板的孔酶标板的1 1、、2 2、、3 3行，每行，每个浓度加个浓度加3 3孔，每孔孔，每孔50μl,50μl,其余孔加待测样，每个样其余孔加待测样，每个样品重复品重复3 3孔，每孔孔，每孔50μl50μl加加 抗抗 体体Ø在微孔中加入一定量的抗体在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争然后将酶标板加入湿盒内开始竞争Ø竞争条件竞争条件37℃左右左右洗洗 板板将反应液甩干并在报纸上拍净第一将反应液甩干并在报纸上拍净第一次加入洗涤液后要立即甩掉然后再接着次加入洗涤液后要立即甩掉然后再接着加第加第2次共洗涤次共洗涤3次加加“二抗二抗”将适当的酶标二抗，加入将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释样品稀释液中（比如稀释倍数液中（比如稀释倍数1:1000就加就加10μl），混），混匀后，在酶标板每孔加匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入，然后将其放入湿盒内，置湿盒内，置37℃下，温育下，温育洗洗 板板将反应液甩干并在报纸上拍净第一将反应液甩干并在报纸上拍净第一次加入洗涤液后要立即甩掉。

然后再接着次加入洗涤液后要立即甩掉然后再接着加第加第2次共洗涤次共洗涤3次加底物显色加底物显色在每孔中加在每孔中加100μl 邻苯二胺（邻苯二胺（OPD）溶液）溶液（小心勿用手接触（小心勿用手接触OPD），（每），（每10ml溶液中溶液中含含4μl 30% H202混匀，然后放入湿盒内，混匀，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加孔颜色还较浅），每孔加入入50μl 2mol/L硫酸终止反应硫酸终止反应比比 色色 在酶联免疫分光光度计上依次在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品测定标准物各浓度和各样品490nm处的处的OD值 用用酶酶标仪进行行比比色色，，以以0 ng/ml标准准孔孔为空空白白孔孔，，在在波波长450nm处分分别读取取各各标准准孔孔和和样本本孔孔OD值，，以以OD值为横横坐坐标，，“标样激激素素含含量量的的对数数”为纵坐坐标，，在在半半对数数坐坐标纸上上画画出出标准准曲曲线，，以以测定定孔孔的的OD值在在标准准曲曲线上上查出出待待测样品品的的ABA含含量量的的对数数。

利利用用反反对数数求得求得ABA的的绝对含量数数 据据 分分 析析植物激素的测定方法？植物激素的测定方法？Ø生物活性法生物活性法Ø气相色谱（气气相色谱（气-质联机）质联机）Ø液相色谱（液液相色谱（液-质联机）质联机）Ø酶连免疫法（酶连免疫法（ ELISA 法）法）问题：我们该选择哪种板呢？ELISAELISA技术的特点与局限性技术的特点与局限性 （1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性物质形成"免疫吸附剂"；酶标记免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精密度差（批内CV15-20%）；线性范围窄（一个数量级）注意事项注意事项 ：（1）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分混匀反应2）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤不完全3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发4）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴，否则出现较大误差 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验( ( ( (E E E Enzyme-nzyme-nzyme-nzyme-L L L Linked inked inked inked I I I ImmunommunommunommunoS S S Sorbent orbent orbent orbent A A A Assay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)原理原理（以间接性（以间接性ELISA为例）为例）：：显色显色显色显色抗抗 原原医学上重要的抗原医学上重要的抗原伤寒杆菌伤寒杆菌伤寒杆菌伤寒杆菌链球菌链球菌链球菌链球菌痢疾杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒狂犬病病毒狂犬病病毒狂犬病病毒狂犬病病毒抗原的概述•抗原（Ag）是指能与淋巴细胞抗原受体特异性结合，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物在体内、外发生特异性反应的物质•抗原的两个基本特性–免疫原性（免疫原性（immunogenicityimmunogenicity) )–免疫反应性免疫反应性 ( (immunoreactivityimmunoreactivity) )•完全抗原 (complete antigen)•半抗原(hapten)•载体(carrier)半抗原半抗原 + + + +载体载体载体载体抗体抗体抗体抗体BT完全抗原完全抗原完全抗原完全抗原BBBT抗体（抗体（AbAb））•抗体（抗体（antibody,Ab)antibody,Ab)是是B B细胞识别抗原后增细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。

地结合，具有免疫功能•免疫球蛋白（免疫球蛋白（ImmunoglobulinImmunoglobulin，，IgIg）是指具）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白一、基本概念：一、基本概念：二、免疫球蛋白的分子结构二、免疫球蛋白的分子结构免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的基本结构•四肽链结构四肽链结构 ，链间二硫键连接，链间二硫键连接•两条重链（两条重链（H H）和两条轻链（）和两条轻链（L L））•氨基端和羧基端氨基端和羧基端 •根据氨基酸排列顺序的不同分为：根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（可变区（V V）和恒定区（）和恒定区（C C））•可变区（可变区（V V区）：区）：氨基酸组成、排列顺序变化较氨基酸组成、排列顺序变化较大大•恒定区（恒定区（C C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及及 含糖量都比较稳定含糖量都比较稳定可变区与恒定区可变区与恒定区 单克隆和多克隆抗体的比较和用途特异性敏感性均一性McAbPcAb低差无高强有1、用于免疫学检测，辅助临床诊断2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。

•多克隆抗体多克隆抗体：多个抗原决定基：多个抗原决定基————机体机体————多种抗体的混合物多种抗体的混合物•单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody, mAbmonoclonal antibody, mAb））：：由一个由一个B B细胞克隆产生的、针对某一特定抗细胞克隆产生的、针对某一特定抗原决定簇的高度特异性抗体原决定簇的高度特异性抗体•基因工程抗体基因工程抗体六、人工制备的抗体六、人工制备的抗体 用用用用标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性荧光素荧光素荧光素荧光素 ：：：：异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明罗丹明罗丹明罗丹明（红色荧光）（红色荧光）（红色荧光）（红色荧光）放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素： 125125I I、、、、131131I I酶：酶：酶：酶：辣根过氧化物辣根过氧化物辣根过氧化物辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶酶、硷性磷酸酶酶、硷性磷酸酶酶、硷性磷酸酶免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（IFAIFA））））放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（RIARIA））））酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（EIAEIA））））液相（液相（液相（液相（ELISAELISA）、固相（免疫组化技术））、固相（免疫组化技术））、固相（免疫组化技术））、固相（免疫组化技术）间接间接间接间接ELISAELISA双抗夹心法双抗夹心法双抗夹心法双抗夹心法酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（e enzyme nzyme l linked inked i immunommunos sorbent orbent a assay, ssay, ELISAELISA法法法法））））。