血浆游离核酸纯化试剂盒说明书.doc

血浆游离核酸纯化试剂盒说明书产品组成血浆游离核酸纯化试剂盒Cat. No.5次制备311300550次制备3113050纯化柱延长管 连接管 核酸纯化柱2 ml离心管1.5 ml离心管蛋白酶K贮存液Carrier RNA Buffer VLBuffer AC (浓缩液）Buffer WA （浓缩液）Buffer WBR（浓缩液）Buffer TE说明书5个5个5个5个5个1.3 ml×260 µl 26 ml 37 ml1.9 ml1.5 ml2 ml1份 50个50个50个50个50个9 ml×3600 µl 130 ml×2 156 ml×219 ml15 ml20 ml1份 产品储存1. 蛋白酶K贮存液与Carrier RNA可室温运输，收到后请于-20℃储存2. 其他试剂与物品如果储存于室温（15~25℃），可在两年内保持使用性能无明显变化；如果将产品贮存于2~8℃，可延长产品的有效期至两年以上技术支持杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：e-mail: technical@, ：400-0099-857产品介绍本产品适合从1-5ml新鲜的或者是冷冻贮藏的体液样品（包括血浆、血清、尿液、 CSF及细胞培养上清）中分离纯化游离核酸。

特别为从大体积（5 ml)血浆中设计的纯化方案，确保极痕量(1-2 copies/ml)的核酸也能高效地被浓缩、吸附到纯化柱上，痕量的核酸连同Carrier RNA经Buffer WA和Buffer WBR洗涤后，用Buffer TE洗脱，即可用于各种分子生物学实验 用户需自备的试剂与物品1． 无水乙醇、异丙醇2． 50 ml离心管和1.5ml离心管（推荐选用DNase-free & RNase-free的1.5ml离心管）3． 移液器吸头（为避免样品间的污染，请选用含有滤芯的DNase-free & RNase-free移液器吸头）4． 一次性手套及防护用品和纸巾5． 台式小量离心机（可配离心1.5ml离心管和2ml离心管的转子）6． 水浴锅与旋涡震荡器使用前准备1） 如果试剂盒贮存于2~8℃，使用前请提前一天将试剂盒放置于室温（15~25℃）环境中2） 如果离心机有制冷功能，请将温度设置到25℃3）将水浴锅温度设置到60℃，并将Buffer TE在60℃温育4) 根据试剂瓶标签上的指示在Buffer AC中加入异丙醇、在Buffer WA和Buffer WBR中加入无水乙醇，并在标签的方框中打勾作好“乙醇已加”的标记。

操作步骤以下步骤是从5 ml 血浆中分离核酸而设计的，如果从其他体积的血浆中分离核酸，按每1 ml血浆+100 µl蛋白酶贮存液+1 ml Buffer VL+ 2 ml Buffer AC的比例加入相应试剂；Carrier RNA、Buffer WA、Buffer WBR及Buffer TE的用量则保持不变1. 吸取500 µl蛋白酶K分别加入到50 ml离心管（用户自备）中，再加入5ml血浆样本 尽量采用新鲜分离的或者冻融不超过一次的血浆进行核酸的分离纯化使用冻融超过一次以上的血浆进行核酸分离时，应先将血浆于6800 rpm离心3分钟，吸取上清进行核酸的分离；否则血浆中因反复冻融所产生的冷凝蛋白可能在操作过程中堵塞核酸纯化柱，导致核酸分离失败 某些用于检测的核酸片段在每毫升血浆中仅有几个拷贝，因此在条件允许的前提下，应尽可能使用最大体积的血浆样本进行核酸的浓缩与纯化 不要将蛋白酶K直接加入到Buffer VL中2. 加入5 ml Buffer VL，再加入10 µl Carrier RNA，旋涡振荡约30秒混匀3. 将离心管置于60℃水浴30分钟4. 加入10 ml Buffer AC，混合均匀。

确认在Buffer AC中已经加入异丙醇5. 将连接管插入到负压装置的插口上；再在连接管上插上核酸纯化柱；最后在核酸纯化柱上插入纯化柱延长管（详见负压装置说明书）将步骤4中的混合液倒入纯化柱延长管中，开启负压，使液体全部滤过核酸纯化柱为了避免交叉污染，请不要将连接管重复使用为了避免交叉污染，不要将纯化柱直接插入到负压装置的插口上6. 暂停负压，取下并丢弃纯化柱延长管加600 µl Buffer WA到纯化柱中，开启负压吸尽纯化柱中溶液 确认在Buffer WA中已经加入无水乙醇7. 暂停负压，加800 µl Buffer WBR到纯化柱中，开启负压吸尽纯化柱中溶液 确认在Buffer WBR中已经加入无水乙醇8. 暂停负压，加900 µl无水乙醇到纯化柱中，开启负压吸尽纯化柱中溶液9. 关闭负压，待负压消失后取下并丢弃连接管，盖上纯化柱管盖，将核酸纯化柱放入试剂盒提供的2ml离心管中，14000 rpm 离心1分钟 如果离心机的离心速度达不到14000 rpm，则用最高速离心2分钟 请勿省略该步骤，否则可能因所纯化的核酸中混有乙醇而影响后续的PCR效果10. 弃2ml 离心管，将核酸纯化柱置于一个试剂盒提供的1.5 ml 离心管中，在纯化柱的膜中央加入50 µl Buffer TE，盖上管盖，室温静置3分钟，12000 rpm 离心30秒。

用低于50 µl的洗脱体积洗脱核酸，并不能确保增加核酸的浓度，相反可能因膜不能被完全润湿而降低核酸的洗脱效率在50 µl PCR反应体系中，加入20 µl 用本产品纯化的核酸作为模板，未见明显的抑制反应推荐用增加模板使用量的方法提高检测的灵敏度11. 弃纯化柱，洗脱的血浆游离核酸可立即用于PCR或RT-PCR检测，或者将核酸储存于-20℃或更低的温度条件下备用。