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免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术1 第一节第一节   基基  本本  原原  理理       抗抗原原＋＋抗抗体体（（特特异异性性））＋＋酶酶标标记记抗抗体体，，通通过过酶酶与与底底物物作作用用生生成成有有色色反反应应物物，，定定位位组组织织或或细细胞胞内内抗抗原原的的一门技术一门技术2免疫酶组化免疫酶组化 免疫学免疫学(抗原抗体反应抗原抗体反应) 酶细胞化学酶细胞化学(底物显色反应底物显色反应)+特异性特异性      敏感性敏感性       定位性定位性      可视性可视性3PAP法法4免疫酶组织化学基本组成：免疫酶组织化学基本组成：抗原抗原 ↓抗体抗体 ↓放大系统放大系统 ↓显色系统显色系统5ABC法法6免疫酶特点：免疫酶特点：        信号定位准确信号定位准确        标本可长期保存标本可长期保存        阳性标记与病变关系阳性标记与病变关系        方法简便，易推广方法简便，易推广7 一、酶及其特点一、酶及其特点 酶选择标准：酶选择标准：  ★★ 该该酶酶用用细细胞胞化化学学易易于于被被检检出出，，能能被被光光镜镜或或电镜观察。

电镜观察  ★★ 酶酶反反应应产产物物须须稳稳定定，，不不扩扩散散，，具具有有良良好好定定位第二节第二节 酶酶 和和 底底 物物8 ★★ 酶易于纯化，获得纯制品酶易于纯化，获得纯制品 ★★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性 ★★ 酶在酶在PH中性液内较稳定中性液内较稳定 ★★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶组织中不应存在与底物作用的内源性酶9符合上述条件：符合上述条件：     辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶      碱性磷酸酶碱性磷酸酶      葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶10（一）辣根过氧化物酶（一）辣根过氧化物酶（（HRP））★★   分子量（分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位），不会遮盖抗原的结合部位★★   稳定，易获得较高纯度酶稳定，易获得较高纯度酶★★   具有较高活性及特异性具有较高活性及特异性★★   可溶性佳，生成的产物不扩散可溶性佳，生成的产物不扩散★★   组织中内源性酶较少组织中内源性酶较少★★   可作用于多种底物，产生不同颜色可作用于多种底物，产生不同颜色★★   HRP穿透力强，易进入细胞内穿透力强，易进入细胞内11 （二）碱性磷酸酶（二）碱性磷酸酶（（AKP））  从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取     ●    组织穿透能力较弱组织穿透能力较弱     ●    内源性内源性AKP较高较高     ●    左旋咪唑具有抑制作用左旋咪唑具有抑制作用 12 （三）葡萄糖氧化酶（（三）葡萄糖氧化酶（GODGOD））     底物为葡萄糖，终产物稳定底物为葡萄糖，终产物稳定     ●    体内无内源性体内无内源性GOD     ●    分子量大，穿透力较弱分子量大，穿透力较弱 13 二、底物及其特点二、底物及其特点      酶酶＋＋底底物物→酶酶·底底物物→酶酶＋＋产物（显色）产物（显色）14HRP的底物：的底物：      HRP的底物为低浓度的的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。

供氢体为胺类及酚类化合物 15HRP显色反应：显色反应：      HRP＋＋H2O2                  HRP＋＋H2O＋＋电子供体（氧化型）电子供体（氧化型）    电子供体电子供体16      电电子子供供体体被被氧氧化化后后，，迅迅速速改改变变颜颜色色，，通通过过聚聚合合等等反反应应，，生生成成不不溶溶性有色颗粒，并就地原位沉淀性有色颗粒，并就地原位沉淀17HRP常用的电子供体：常用的电子供体：●   3.3-二氨基联苯胺二氨基联苯胺(DAB)～棕色～棕色●   氨氨乙乙基基卡卡巴巴唑唑(AEC)～～红红色色，，易易溶溶于于有有机机溶溶剂剂，，易扩散，用水溶性封固剂易扩散，用水溶性封固剂●  4-氯氯-1-茶茶酚酚（（4CN））～～蓝蓝色色，，易易弥弥散散，，不不能能久久保保存存●    3.3，，5.5-四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)  ～黄色～黄色18AKP底物：底物：        AKP常常用用的的底底物物为为α-萘萘酚酚AS-B1磷酸盐磷酸盐    偶联试剂：偶联试剂：固兰固兰BB～蓝色～蓝色                        固红固红TR～红色～红色 19第三节第三节   酶标记抗体法酶标记抗体法    酶酶标标记记抗抗体体法法（（Enzayme Labelled antibody））是是将将酶酶通通过过共共价价键键结结合合在在抗抗体体分分子子上上，，制制备备成成酶酶标标记记抗抗体体，，通通过抗体去寻找相应抗原。

过抗体去寻找相应抗原 20一、直接法一、直接法原理：原理：HRP标记在特异性抗体标记在特异性抗体          （第一抗体）上，抗原（第一抗体）上，抗原---           抗体抗体● HRP复合物复合物21组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体过氧化物酶过氧化物酶直接法直接法22步骤：步骤：一步完成一步完成特点：特点：方法简便、省时，专一方法简便、省时，专一            性强，非特异染色轻，性强，非特异染色轻，            但敏感性差，一种标记但敏感性差，一种标记            抗体只能检测一种抗原抗体只能检测一种抗原23二、间接法二、间接法原理：原理：HRP标记在第二抗体上，标记在第二抗体上，             抗原抗原---特异性抗体特异性抗体---第第             二抗体二抗体● HRP复合物复合物步骤：步骤：二步法二步法24组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体过氧化物酶过氧化物酶间接法间接法25特点：特点：敏感性较直接法高，一敏感性较直接法高，一            种标记抗体能用于相应种标记抗体能用于相应            动物制备的多种特异性动物制备的多种特异性            抗体，检测多种抗原。

抗体，检测多种抗原            但较直接法费时，非特但较直接法费时，非特            异染色稍重异染色稍重 26第四节第四节   酶酶 抗抗 酶酶 法法●    制备抗酶抗体制备抗酶抗体●    制备制备PAP复合物复合物27酶桥法酶桥法组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）第三抗体（抗酶抗体）HRP28一、一、PAP法法原理：原理：抗原抗原---特异性抗体特异性抗体---第第            二抗体（桥抗体）二抗体（桥抗体）---            PAP复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法29组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物PAP法法HRP30特点：特点：     敏感性较高，背景染色较轻敏感性较高，背景染色较轻     但特异性抗体与但特异性抗体与PAP必须为必须为     同一种属动物同一种属动物 31二、双二、双PAPPAP法：法：原原 理理 ：： 在在 PAP的的 基基 础础 上上 再再 重重 复复             第二抗体和第二抗体和PAP复合物复合物抗原抗原---特异性抗体特异性抗体---第二抗体（桥抗第二抗体（桥抗体）体）---PAP ---第二抗体第二抗体--- PAP复合物复合物    32组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物双双PAP法法HRP33双双PAP法法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物HRP34步骤：步骤：五步法五步法 特点：特点：敏感性较高敏感性较高缺点：缺点：但步骤多，费时，非特但步骤多，费时，非特            异背景重异背景重35三、三、APAAPAPAAP法法原理：原理：抗原抗原---特异抗体特异抗体---第二第二            抗体抗体--- APAAP复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法36APAAP法法37特点：特点：非特异背景较轻，不受内非特异背景较轻，不受内            源性酶的干扰。

源性酶的干扰            但产物易溶于有机溶剂但产物易溶于有机溶剂38    第五节第五节 卵白素卵白素---生物素生物素Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成亚基组成Biotin小分子维生素小分子维生素Avidin和和Biotin具有较高亲和力具有较高亲和力39一一 、、ABC法法          Avidin Biotin Complex原理：原理：酶标记酶标记Biotin形成酶素化形成酶素化             Biotin40   酶素化酶素化Biotin＋＋Avidin --- ABC    复合物复合物   抗原抗原---特异抗体特异抗体--- Biotin标记标记        第二抗第二抗--- Avidin ● Biotin ● HRP 41组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体HRP生物素生物素卵白素卵白素ABC法法42步骤：步骤：三步法三步法特点：特点：敏感性较高，特异性强，敏感性较高，特异性强，             应用范围广应用范围广      43 ●   某些脏器存在内源性生物素某些脏器存在内源性生物素      干扰干扰●  Avidin与核酸及细胞膜中磷脂与核酸及细胞膜中磷脂     有非特异反应有非特异反应44SABC法法      Streptavidin  biotin  Peroxidase   Complex      SABC法已代替法已代替ABC法法45 二、二、LSAB法法    Labelled  Streptavidin  Biotin Method原理：原理： ● Biotin标记第二抗体标记第二抗体46LSAB法法47● HRP标记标记Avidin     抗抗原原---特特异异性性抗抗体体---Biotin标标记记第二抗体第二抗体---Avidin ● HRP复合物复合物 48步骤：步骤：三步法三步法特点：特点：敏感性高，特异性强，敏感性高，特异性强，           方法简便方法简便49第六节第六节 多聚合物酶法多聚合物酶法 HRP---HRP---多聚合物多聚合物------抗体抗体 一、一、Epos法法        Enhanced polymer one-step staining50多聚合物酶法多聚合物酶法51组织抗原组织抗原一抗一抗HRP多聚骨架多聚骨架EPOS 方法方法52原理：原理：采用一种具有惰性的多聚采用一种具有惰性的多聚            化合物作为骨架，将特异化合物作为骨架，将特异            性抗体和性抗体和HRP，同时标记，同时标记            在多聚合物分子上，形成在多聚合物分子上，形成            HRP---多聚合物多聚合物---特异性特异性           抗体。

抗体 53步骤：步骤：一步法一步法特点：特点：快速，简便，特异性强，快速，简便，特异性强，             敏感性高敏感性高             但商品化种类不全，但商品化种类不全，             价格昂贵价格昂贵54二、二、EnVision法法        Enhanced Labelled Polymer System原理：原理：HRP ---多聚合物多聚合物---第二第二            抗体抗体55组织抗原组织抗原一抗一抗二抗二抗酶酶多聚骨架多聚骨架第一步第一步第二步第二步EnVisionTM方法方法56特点：特点：敏敏感感性性高高：：（（1 mole复复合合物物中中含含70mole HRP和和10 mole第二抗体）第二抗体）      特异性强：特异性强：  复合物内无内源性复合物内无内源性Avidin和和Biotin的干扰57第七节第七节 基本操作步骤基本操作步骤 1. 抗原修复抗原修复2.内内源源性性过过氧氧化化物抑制物抑制3. 正常血清封闭正常血清封闭4. 第一抗体第一抗体5. 第二抗体第二抗体6. 酶标记体酶标记体7. DAB- H2O2显色显色58第八节第八节 抗原定位及非特异染色抗原定位及非特异染色 59    组织细胞组织细胞        ＊＊固定问题固定问题     ＊＊脱蜡不彻底脱蜡不彻底     ＊＊内源性过氧化物内源性过氧化物     ＊＊内源性生物素内源性生物素 60抗原抗原    ＊＊抗原弥散抗原弥散 ＊＊抗原异常表达抗原异常表达 ＊＊共同抗原决定簇共同抗原决定簇 61特异性抗体特异性抗体   ＊＊非特异吸附非特异吸附 ＊＊抗体不纯抗体不纯 ＊＊交叉反应交叉反应 62   第二抗体第二抗体        ＊＊ IgG交叉反应交叉反应     ＊＊ 二抗不纯二抗不纯63标记物标记物 ＊＊质量质量 ＊＊纯度纯度 ＊＊标记水平标记水平 64底物溶液底物溶液   ＊＊ DAB ＊＊ H2O2 65操作操作     ＊＊复染复染   ＊＊抗体稀释度抗体稀释度   ＊＊孵育时间孵育时间   ＊＊ PAS洗涤洗涤 66第九节第九节   免疫酶方法评价免疫酶方法评价 67              素材和资料部分来自素材和资料部分来自网络，如有帮助请下载网络，如有帮助请下载!。