第六章 柠檬酸发酵机制.ppt

第六章 柠檬酸发酵机制重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物合成的代谢调节；三羧酸循环的调节；物合成的代谢调节；三羧酸循环的调节； 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节；糖难点：柠檬酸生物合成的代谢调节；糖酵解及丙酮酸代谢的调节酵解及丙酮酸代谢的调节；； 第一节第一节 柠檬酸合成途径柠檬酸合成途径 柠檬酸又名枸橼酸，学名柠檬酸又名枸橼酸，学名α-α-羟基丙烷羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一三羧酸，是生物体主要代谢产物之一 n n柠檬酸合成途径：柠檬酸合成途径： 丙丙 乙酰乙酰COACOA葡萄糖葡萄糖 酮酮 → →柠檬酸柠檬酸 酸酸 草酰乙酸草酰乙酸 (参参P53图图4-1) EMP氧化脱羧氧化脱羧羧化羧化黑曲霉能够利用糖类、乙醇和醋酸生成柠檬酸。

黑曲霉能够利用糖类、乙醇和醋酸生成柠檬酸n nJagnnathanJagnnathan等等19531953年证实黑曲霉存在年证实黑曲霉存在EMPEMP途径的途径的所有酶；所有酶；n nRamakrishmanRamakrishman 和和 Martin Martin 等在等在1954-19551954-1955年间研年间研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶素，证明了究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶素，证明了黑曲霉存在三羧酸循环黑曲霉存在三羧酸循环柠檬酸积累，三羧酸循环阻断，合成柠檬酸柠檬酸积累，三羧酸循环阻断，合成柠檬酸所需的草酰乙酸如何得到？所需的草酰乙酸如何得到？n n研究证实：草酰乙酸由丙酮酸（研究证实：草酰乙酸由丙酮酸（PYRPYR）或磷酸烯）或磷酸烯醇式丙酮酸（醇式丙酮酸（PEPPEP）羧化形成羧化形成PYR+COPYR+CO2 2+ATP +ATP 草酰乙酸草酰乙酸+ +ADP+PiADP+Pi KeqKeq=0.818=0.818PEP+COPEP+CO2 2+ADP +ADP 草酰乙酸草酰乙酸+ATP+ATP KeqKeq=0.049=0.049n n碳平衡碳平衡由葡萄糖生成柠檬酸的总反应式：由葡萄糖生成柠檬酸的总反应式： 丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶n n能量平衡能量平衡n n由由EMP 途径底物水平磷酸化产生途径底物水平磷酸化产生2个个ATP，由氧，由氧化磷酸化产生化磷酸化产生9个个ATP，可供菌体维持渗透功能，可供菌体维持渗透功能等需要，不必再消耗碳源经由等需要，不必再消耗碳源经由TCA循环产生能量。

循环产生能量n n葡萄糖生成柠檬酸的碳和能量是平衡的葡萄糖生成柠檬酸的碳和能量是平衡的第二节 柠檬酸生物合成的代谢调节n n为什么黑曲霉能够大量积累柠檬酸？n n柠檬酸引起反馈调节是如何进行的，而且最终被克服？；n n什么机制造成柠檬酸积累？一、糖酵解及丙酮酸代谢的调节一、糖酵解及丙酮酸代谢的调节1.1.磷酸果糖激酶（磷酸果糖激酶（PFKPFK）是第一调节点）是第一调节点 在正常情况下，柠檬酸、在正常情况下，柠檬酸、ATPATP对磷酸果糖对磷酸果糖激酶（激酶（PFKPFK）有抑制作用，而）有抑制作用，而AMPAMP、无机磷、、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，铵离子对该酶则有激活作用，NHNH4 4+ +能解除柠能解除柠檬酸、檬酸、ATPATP对磷酸果糖激酶的抑制作用对磷酸果糖激酶的抑制作用 研究表明研究表明: :NHNH4 4+ +与柠檬酸生产速度有密切关系，与柠檬酸生产速度有密切关系，正是细胞内正是细胞内NHNH4 4+ +浓度升高，使浓度升高，使PFKPFK对细胞内对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感积累的大量柠檬酸不敏感n n 比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。

有关 MnMn2+2+的效应是通过的效应是通过NHNH4 4+ +水平升高而减少水平升高而减少柠檬酸对柠檬酸对PFKPFK的抑制，的抑制，NHNH4 4+ +水平升高是因水平升高是因MnMn2+2+缺乏使蛋白质和核酸合成受阻缺乏使蛋白质和核酸合成受阻2.2.丙酮酸激酶是丙酮酸激酶是EMPEMP途径的第途径的第2 2个调节点，个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实3.3.丙酮酸重要分叉点丙酮酸重要分叉点 丙酮酸羧化酶不被乙酰丙酮酸羧化酶不被乙酰CoACoA抑制，该酶抑制，该酶的调节性差，从而保证了草酰乙酸的提的调节性差，从而保证了草酰乙酸的提供二、三羧酸循环的调节二、三羧酸循环的调节1. TCA1. TCA循环的起始酶：柠檬酸合成酶循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶但在黑曲霉中，柠是一种调节酶但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉曲霉TCATCA循环的第一个特点循环的第一个特点2.2.顺乌头酸水合酶、顺乌头酸水合酶、NADNAD和和NADP-NADP-异柠檬酸脱异柠檬酸脱氢酶活性在氢酶活性在pH2.0pH2.0情况下，三种酶均不呈现情况下，三种酶均不呈现活性。

发酵中柠檬酸正是在该酸度下积累发酵中柠檬酸正是在该酸度下积累 柠檬酸是如何开始积累？柠檬酸是如何开始积累？ 黑曲霉中一种单纯的，位于线粒体上的顺乌黑曲霉中一种单纯的，位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立如下平衡：头酸水合酶，它在催化时能建立如下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90=90：：3 3：：7 73.3.第二个特点：黑曲霉菌体内第二个特点：黑曲霉菌体内α-α-酮戊二酸脱酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（氢酶缺失或活力很低（TCATCA环被阻断）环被阻断） α-α-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖和酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖和NHNH4 4+ +的的抑制，在柠檬酸生成期，菌体内不存在抑制，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低酮戊二酸脱氢酶或活力很低 此酶是此酶是TCATCA循环中唯一不可逆反应步骤循环中唯一不可逆反应步骤这时苹果酸、富马酸、琥珀酸由草酰乙酸这时苹果酸、富马酸、琥珀酸由草酰乙酸生成，这种现象称为生成，这种现象称为TCATCA循环的马蹄形表达循环的马蹄形表达形式4.4.氧和氧和pHpH值对柠檬酸发酵的影响很大。

值对柠檬酸发酵的影响很大归纳：归纳：①①MnMn2+2+缺乏缺乏→→抑制蛋白合成抑制蛋白合成→→NHNH4+4+↑ ↑ 有一条呼吸活动强的不产生有一条呼吸活动强的不产生ATPATP的侧呼吸链的侧呼吸链解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途途径畅通径畅通②②由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制丙酮酸氧化脱羧生成乙酰丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoACoA和和COCO2 2的固定两个反的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力合成柠檬酸的能力③③由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90=90：：3 3：：7 7 同时控制同时控制FeFe2+2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。

使柠檬酸积累④④随着柠檬酸积累，随着柠檬酸积累，pHpH降低到一定程度降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外  复习思考题n n简述柠檬酸生物合成的代谢调节简述柠檬酸生物合成的代谢调节n n柠檬酸积累机制是什么？柠檬酸积累机制是什么？n n什么是乙醛酸循环？什么是乙醛酸循环？。