王镜岩生化课件06 核酸.ppt

第六章第六章           核核 酸酸第一节第一节   核酸的化学组成核酸的化学组成核  酸核苷酸 磷酸 核苷戊糖碱基P330 表5-1  两类核酸的基本化学组成RNA： D-核糖， A、G、C、U碱基DNA： D-2-脱氧核糖， A、G、C、T碱基  一、一、  碱基碱基1. 嘌呤碱：        腺嘌呤 A   鸟嘌呤 G2. 嘧啶碱：     胞嘧啶 C  尿嘧啶 U  胸腺嘧啶 T P331 结构式  3. 修饰碱基： 100余种，多数是甲基化的产物植物中有大量5-甲基胞嘧啶E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C二、二、  核苷与脱氧核苷核苷与脱氧核苷核酸中的核苷与脱氧核苷均为β-型嘧啶碱： C1 —N1，嘌呤碱： C1 —N9 P332  结构式  腺嘌呤核苷    胞嘧啶脱氧核苷三、三、  核苷酸核苷酸核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化 P332结构式：5’-AMP    3’-dCMP 1、、 构成构成DNA、、RNA的核苷酸的核苷酸     P481表表13-4DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA：  AMP、   GMP、  CMP、  UMP2、、   细胞内游离核苷酸及其衍生物细胞内游离核苷酸及其衍生物①核苷5’-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。

②环核苷酸3’,5’-cAMP， 3’,5’-cGMP激素的第二信使，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物ppGpp    pppGpp    ppApp④核苷酸衍生物HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等辅助因子GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体第二节第二节   DNA的结构的结构一级：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序二级：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象一、一、  DNA的一级结构的一级结构dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3’、5’-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体   P483  图 13-2 写法：5’→3’：5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’ 二、二、  DNA的二级结构的二级结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型★Chargaff 规律   1950年a. 所有DNA中，A=T，G=C  且A+G=C+TP486b. DNA的碱基组成具有种的特异性。

c. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性d. 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成★ DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析Franklin相 对 湿 度 92%： B—DNA相 对 湿 度 75%： A—DNA                             Z—DNA1、、   Watson-Crick双螺旋结构模型双螺旋结构模型(B-DNA)P486图13—5★ 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’★ 嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧★ 磷酸与脱氧核糖彼此通过3’、5’-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架★ 两条核苷酸链，依靠碱基间形成的氢链结合在一起A=T、G=C★ 每圈螺旋含10个核苷酸，碱基堆积距离0.34nm，螺距：3.4nm，双螺旋平均直径2nm， 大沟：宽1.2nm ，深0.85nm，小沟 ：宽0.6nm，深0.75nmP487 图13-6   13-72、稳定双螺旋结构的因素、稳定双螺旋结构的因素①碱基堆积力（主要因素） 形成疏水环境②碱基配对的氢键。

GC含量越多，越稳定③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击三、三、  DNA二级结构的多型性二级结构的多型性P489  表13-6 A-、B-、Z-DNA的比较1、、   B—DNA：：典型的典型的Watson-Crick双螺旋双螺旋DNA右手双股螺旋每圈螺旋10.4个碱基对螺旋扭角36°螺距：3.32nm碱基倾角：1°生物体内DNA均为B—DNA2、、   A-DNA在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维右手双螺旋，外形粗短RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构3、、   Z-DNA左手螺旋的DNA天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA4、、   DNA三股螺旋（三股螺旋（ H-DNA）DNA的三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始位点或调节位点第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达四、四、  DNA二级结构的不均一性二级结构的不均一性1、、   反向重复序列（回文序列）反向重复序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同。

较长的回文结构，可形成茎环结构和发夹结构转录的终止作用与回文结构有关较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点2、、   富含富含AT的序列的序列很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT碱基对特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区，富含AT对五、五、  环状环状DNA某些病毒DNA某些噬菌体DNA某些细菌染色体DNA细菌质粒DNA真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA1、、   环状环状DNA的不同构象的不同构象P491图13-12  松驰环、解链环、负超螺旋（（1）、）、  松弛环形松弛环形DNA线形DNA直接环化（（2）、）、  解链环形解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（（3）、）、 正超螺旋与负超螺旋正超螺旋与负超螺旋DNA正超螺旋：在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋负超螺旋：在绳子一端向松弛方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋2、、 环形环形DNA的拓扑学特性的拓扑学特性以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4=25。

①连环数（L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示松驰环：L=25解链环：L=23超螺旋：L=23②缠绕数（T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示松驰环T=25解链环T=23超螺旋T=25③超螺旋周数（扭曲数W）松驰环W=0解链环W=0超螺旋W= -2L=T+W④比连环差（λ）表示DNA的超螺旋程度λ=（L—L0）/L0L0是指松驰环形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03~-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等Superhelix densityσ=γ/β=每一圈初级螺旋（10bp，360°）出现超螺旋数不同生物的DNA分子的大小不同形成几乎相同的超螺旋密度SV40  5226bp      T=522   W=-26(L=496) σ=-0.05E.coli  4.2X106bp  T=4.2X105  W=4.2X105X-0.05=-2X104一般天然DNA分子中σ=-0.05=5%负向超螺旋3、、   拓扑异构酶拓扑异构酶改变DNA拓扑异构体的L值。

①拓扑异构酶酶I（拧紧）能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋②拓扑异构酶酶II（拧松）能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA六、六、  DNA的生物学功能的生物学功能首次直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验 P342  1~4   Avery的肺炎双球菌转化实验第三节第三节    RNA的结构的结构一、一、  RNA的一级结构的一级结构AMP、GMP、CMP、UMP通过3’、5’磷酸二酯键形成的线形多聚体 P484  图13-3  RNA基本结构①①    组成组成RNA的戊糖是核糖的戊糖是核糖②②    RNA的的U替替代代DNA中中的的T，，此此外外，，RNA中中常常有有一些稀有碱基一些稀有碱基③③    天天然然RNA分分子子都都是是单单链链线线形形分分子子，，只只有有部部分分区区域是域是A-型双螺旋结构型双螺旋结构二、二、  RNA的类型的类型核糖体RNA：    rRNA   转运  RNA：    tRNA信使  RNA：   mRNA    核内小RNA： snRNA （small nuclear RNA ） P344  表5-7  大肠杆菌中的RNA三、三、  tRNA的结构的结构 ① 70-90b，分子量在25kd左右，沉降系数4S左右②有较多稀有碱基      图③3’末端为…CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。

④5’末端大多为pG…或pC…⑤二级结构是三叶草形 P496  图46-18  tRNA的二级结构（三叶草模型） 四、四、  mRNA的结构的结构1、、   真核真核mRNA的结构的结构（（1）、）、  3’-端有一段约端有一段约30-300核苷酸的核苷酸的polyA PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短2）、）、  5’-帽子帽子P346   帽子结构：帽子结构： 3’-mG-5’ppp5’-Nm-3’-P5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5’-5’-磷酸二酯键帽子的功能：★可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA   ★ 可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成2、、   原核原核mRNA的结构（多顺反子）的结构（多顺反子）由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成没有5’帽子和3’polyASD序列：5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。

SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补六、六、  rRNA的结构的结构rRNA与核糖体蛋白结合一起构成核糖体大肠杆菌中有三类rRNA：5S rRNA，，16S rRNA，23S rRNA真核细胞有四类rRNA：5S rRNA，5.8S rRNA，8SrRNA28S rRNA  P346  图5-14   大肠杆菌  5S rRNA  结构第四节第四节    核酸的性质核酸的性质一、一、  解离性质解离性质磷酸和碱基能发生两性解离DNA等电点  4—4.5RNA 等电点 2—2.5二、二、  水解性质水解性质1、、   碱水解碱水解室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物         图 在相同条件下，DNA不被水解这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义：DNA稳定 ，遗传信息RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解2、、   酶水解酶水解RNA水解酶  RNaseDNA水解酶  DNase核酸外切酶核酸内切酶 ：限制性核酸内切酶三、三、  光吸收性光吸收性碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，　λmax=260nm1、、   鉴定纯度鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。

纯RNA的A260/A280应为2.0若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低2、、   含量计算含量计算1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA                  或：40ug/mL单链DNA（或RNA）                  或：20ug/mL核苷酸3、、   增色效应与减色效应增色效应与减色效应P347  图5-15  DNA的紫外吸收光谱 增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小四、四、  沉降特性（沉降特性（DNA））不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化       P348 图5—16  Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA 相对沉降常数线型双螺旋分子                1.00松驰双链闭环                    1.14切刻双链环                        1.14单链环                                1.14线型单链                            1.30正超或负超螺旋双链环状        1.41坍缩                                     3.0五、五、  变性、复性变性、复性1、、   变性变性★核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。

★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内P350  图5-18变性过程  因素 ：热变性             酸碱变性（pH小于4或大于11）            变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）   变性后 ：260nm吸收值升高                 粘度降低，浮力密度升高                二级结构改变，部分失活  （（1）、）、 熔解温度（熔解温度（Tm）：）：★DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度浓度50ug/mL时，双链DNA  A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为TmDNA的Tm一般在70—85℃之间（（2）、）、 影响影响DNA的的Tm值的因素值的因素①DNA均一性   均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内②G-C含量与Tm值成正比测定Tm，可推知G-C含量G-C%=（Tm-69.3）×2.44 P351图5-19     图5-20   Tm值与GC含量的关系③介质中离子强度其它条件不变，离子强度高，Tm高P351    图5-212、、   复性复性变性DNA在适当（一般低于Tm20—25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。

变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快复性速度可用Co·t衡量Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示 P352  图5-22，不同DNA的复性时间★1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0m mol/L，则50%复性时， Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部复性，     Cot=10-4，  t=0.1秒★E.coli  4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则复性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，5758天★复性机制：10-20bp成拉链第五节第五节   核酸研究技术核酸研究技术一、一、  核酸的分离纯化核酸的分离纯化尽可能保持其天然状态条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌抑制核酸酶1、、   DNA分离纯化分离纯化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。

DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质还可用氯仿异戊醇去除蛋白质2、、RNA的的制制备备（（重重点点介介绍绍mRNA的的分分离离、、纯化）纯化）用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）去蛋白：盐酸胍、苯酚等必须防止RNA酶对RNA的破坏二、二、  核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳1、、   琼脂糖电泳琼脂糖电泳① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比②    凝胶浓度③ DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢④    电流，不大于5V/cm2、、   PAGE电泳电泳三、限制性核酸内切酶（三、限制性核酸内切酶（1979年发现）年发现）1、、   限制修饰系统限制修饰系统         图 2、、   II型核酸内切酶型核酸内切酶限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）II型酶的切割频率识别位点 4       44=256                6       46=4096                8       48=65536 限制酶的命名：E.coRI第一位：      属名E（大写）第二、三位：种名的头两个字母小写co第四位： 菌株R第五位： 从该细菌中分离出来的这一类酶的编号同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。

 BamHI：GG↓ATCC     BstI GG↓ATCCMboI  GAT↓C         Sau3A  GAT↓C同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端BclI  TG↓ATCA       BglII  AG↓ATCA   星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化 例如  HindIII   AAG↓CTT 四、四、  DNA物理图谱及构建物理图谱及构建（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础末端标记法构建DNA物理图谱：（1）单酶完全降解和部分降解（2）双酶降解          图五、五、  分子杂交分子杂交1、、   Southern BlottingP353 图5-23DNA样品  →  酶切 →  电泳  → 变性 →  转膜  → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影变性（NaOH 0.5mol/L）转膜（NC膜）固定（80℃，4-6h）杂交（高盐浓度，68℃，几小时）Southern  Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。

可用DNA或RNA探针2、、   Northern Blotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、、   Western Blotting是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术   抗原与抗体的杂交六、六、  DNA序列分析序列分析（一）（一） 化学裂解法（化学裂解法（Maxam-Gilbert 法）法）原理：   利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离  32P-GCTACGTA特异性化学裂解在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处： 32p ，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG硫酸二甲酯特异切割：G                 甲酸特异切割：G和A肼在Nacl条件下切割：C                 肼在无 Nacl条件下切割：T和C32P *ACTTCGACAA硫酸二甲酯：   *ACTTC                             甲酸：                 *P    *ACTTC*ACTTCG *ACTTCGAC                *ACTTCGACA肼（有Nacl）：  *A               *ACTT               *ACTTCGA                                            肼（无Nacl）：  *A     *AC    *ACT                *ACTT*ACTTCGA从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。

（二）（二）      双脱氧终止法双脱氧终止法英国   Sanger     1955  确定牛胰岛素结构，     1958  获诺贝尔化学奖     1980  设计出DNA测序法，     1980  获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群         （三）（三）      序列分析仪序列分析仪四色荧光基团标记的ddNTP七、七、  DNA合成（探针、引物、基因）合成（探针、引物、基因）1、、化学合成：化学合成：固相合成法（亚磷酸三酯法）固相合成法（亚磷酸三酯法）  P353  合成过程合成方向：3’  →      5’端5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护3’-OH用氨基磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护  保护： 5’-OH、活化3’-OH、保护所有NH22、、   DNA的酶合成的酶合成——PCR①模板DNA（单链）②引物③DNA聚合酶④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP ⑤一定浓度的Mg2+合成方向：5  ’ →     3’端 化学合成：方向3’  →   5’，不需DNA模板，酶生物合成：方向5’  →  3’，需模板，引物，DNA聚合酶。