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第五章 糖基磷脂酰肌醇化蛋白 及有关糖复合物 蛋白质锚定在膜表面的新方式 还记得脂筏吗？ ——膜蛋白的引渡船 脂筏的组成成分 n脂筏（lipid raft）是 质膜上富含鞘糖脂、 GPI蛋白和胆固醇的 微结构域（ microdomain） 蛋白质与膜表面的结合方式 1,2：整合蛋白 3,4： 锚定蛋白 5,6： 外周蛋白 糖基磷脂酰肌醇化蛋白 一类由蛋白质、脂质和糖链三者共价结 合的复杂的糖复合物——糖基磷脂酰肌 醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)化蛋 白 GPI蛋白的分布 1985年以锥虫表面抗原为例阐明其结构 GPI蛋白广泛存在于真核生物，包括原生动物、酵母、 粘菌、无脊椎动物等以及哺乳动物的血液、肝、肾、 胎盘和脑等组织 目前已发现近百种GPI蛋白，包括多种水解酶、细胞粘 附分子、哺乳动物细胞表面抗原和受体、原虫抗原、 补体调节蛋白、朊病毒等 GPI化蛋白的种类和分布举例 补体调节蛋白类 粘附分子类 酶类 许多细胞和非造血细胞 反应性溶血膜 抑制物(CD59) 许多细胞和非造血细胞 衰变加速因子 （CD55, DAF) 神经细胞 、胶质细胞神经粘附因子 许多造血细胞CD58 (LFA-3) 哺乳动物组织5`-核苷酸酶 人及羊红细胞、电鳗电器管乙酰胆碱酯酶 胎盘、肠等哺乳动物组织碱性磷酸酶 GPI化蛋白的基本结构 蛋白质： – C末端残基与GPI锚相连，通常为Gly、Ala、Ser、 Cys、Asp、Asn。

有些本身是糖蛋白 磷酸乙醇胺桥 糖链: – 接在肌醇磷酸的6位 – 共有的四糖结构：Man-Man-Man-GlcN 肌醇磷酸 插入脂双层内的长脂肪链： – 脂酰甘油或甘油醚；极个别被神经酰胺取代 GPI锚 GPI化蛋白的结构要点 结构组成 脂肪链与甘油的连接方式 糖链的修饰变化 糖链与肽链的连接 极个别脂酰甘油被Ceramide代替 其它GPI有关糖复合物 存在于一些寄生性原虫表面： – 脂肽磷酸聚糖 (LPPG) – 糖肌醇磷酸聚糖 (GIPL) – 脂磷酸聚糖 (LPG) 糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican) 三种致命的原虫 布氏锥虫（ Trypanosoma brucei ）引起的非洲 昏睡病在撒哈拉以南的非洲地区每年感染５０ 万人，如果得不到及时治疗，往往会“杀人于 昏睡之中” 枯氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起南美锥虫 病，它由锥蝽叮咬人后排泄的粪便传播，在拉 美地区每年导致５万人死亡 硕大利什曼原虫（Leishmania major）引起的 黑热病蔓延５大洲、８０多个国家，是公共卫 生的严重威胁 锥虫(Trypanosomes)和昏睡症 (Sleeping Sickness ) 非洲昏睡病 锥虫寄生之谜 锥虫本身对抗体和补体高 度敏感 它们却生活在布满免疫细 胞的血液系统 它们可引发强烈的免疫反 应 然而他们可以在同一宿主 体内繁殖生活一年或更长 ，直至宿主死亡 the GPI anchor GPI锚的加工是在翻译后 立即添加的 蛋白质的C端疏水区作为 信号肽，可被切除然后以 转肽反应被糖脂取代，形 成GPI化蛋白 锥虫表面的抗原变化 GPI锚可在锥虫表面形成 高度密集的排列 锥虫表面于是形成由可 变表面糖蛋白（Variant Surface Glycoproteins, VSGs）组成的致密外壳 这种外壳与利氏曼原虫 表面的脂磷（酸）聚糖 相当 锥虫的基因组与VSG 锥虫为单细胞真核生物，其染色体为二倍体。

布氏锥虫含有100 个小染色体和20个较大染色体，编码VSG的基因在各种染色体 上都有 锥虫基因组中的6-10%编码VSGs (more than 1000 genes) 根据在染色体上的位置分为内部VSG基因和端粒VSG基因， VSG基因的表达总是在端粒的表达位点（Expression site, ES） 上进行表达位点有多个，但一定时期只激活一个 在特定时期只有一种VSG基因表达，而其他999种都被关闭 VSG基因表达的转换以很低几率发生，如果宿主产生了对前一 种VSG的抗体，则新的表达型就会迅速扩增起来 – What is the advantage of expressing a single VSG? – How is expression controlled? – What mechanisms can you think of by which a cell could control gene expression and protein abundance? Antigenic variation 所有的VSGs都是65 kDa的 GPI蛋白，在细 胞表面呈二聚体 蛋白的外端高度可变， 但Cys的位置保守 其他非可变蛋白如转铁 蛋白受体或己糖转运体 隐藏在表面外壳内部 Antigenic variation 锥虫基因组中有1000个基因编码表面抗原 但每个特定时期只有一个VSG基因被表达 – 启动子调节？ – 基因的位置？ – 其他机制？ 转座效应 Transposition of VSG genes occurs by intra- or intermolecular recombination This explains switching but not really why one gene is active and all the others are silent 碱基的稀有修饰 染色质修饰调控基因表达 – 实际上发现失活和激活部位的一种特殊修饰（标记 为J (b-glucosyl-hydroxy-methyluracil)有差异 But is this a chicken or an egg? GPI抗原的“漂移”？ 在非洲锥虫病病人的红细胞膜上发现了 锥虫的一种GPI蛋白表面抗原！ GPI锚介导蛋白质在细胞表面转移——细 胞表面工程 许多细菌、寄生虫毒性蛋白也是GPI蛋白 ，可把毒素转移给宿主细胞。

如何抑制 ？ GPI化蛋白的生物合成 核糖体合成 新生肽链 内质网腔 N-端去除 15~30aa信号肽 C-端去除 15~30个aa 肌醇磷酸 GPI锚 GPI化蛋白 细胞质 逐个添加糖基 磷酸乙醇胺 运往质膜表面 Biosynthetic pathway of GPI-anchor Proteolytic cleavage at w site Addition of preformed GPI anchor at C-terminus through an amide linkage to the ethanolamine of the GPI anchor Protein can be released by action of cell surface phospholipase GPI = glycosylphosphatidylinositol: lipid modification that anchors proteins to the cell surface GPI化 标记 GPI化蛋白运送到质膜表面的方式 小窝蛋白 GPI化蛋白的降解 磷脂酰肌 醇4,5二磷 酸(PIP2) PLC IP3 DAGPKC Ca2+ GPI 蛋白 PLC DAG GPI化蛋白的生物功能 免疫及神经细胞活化： – T细胞活化 – 神经细胞表面的N-CAM和CNTF受体 与信号转导：脂筏 作为受体 – 叶酸受体 – 墨素转铁蛋白(melanotransferrin) GPI蛋白锚定的优势 可能赋予膜蛋白的较大的横向运动性 通过激活脂酶介导蛋白质的释放和分泌 靶向膜蛋白使其定位于细胞表面特定的 区域 通过内吞作用调节细胞表面蛋白质的周 转 参与受体介导的传递跨膜信号 GPI锚定蛋白的鉴定 水解细胞膜表面蛋白的GPI锚 – 细菌中提取的PI-PLC – 锥虫中的GPI-PLC – 血清中GPI-PLD – 氢氟酸 – 稀亚硝酸 Western blot鉴定 GPI裂解位点 •Enzymatic and chemical cleavage sites of GPI anchors useful in identifying GPI- anchored membrane proteins. •(GPI-PLC) GPI-specific phospholipase C; •(GPI-PLD) GPI-specific phospholipase D; •(HF) hydrogen fluoride; (HONO) nitrous acid; •(NaOH [NH3]) mild alkali treatment with either sodium hydroxide or ammonia; •(PI-PLC) phosphatidylinositol- specific phospholipase C. GPI化蛋白与疾病和药物设计 阵发性夜间血红蛋白尿症 (PNH) GPI化蛋白与细胞表面工程 GPI化蛋白与抗感染药物设计 – 通过抑制GPI锚结合蛋白从膜上释放而抑制 病原毒素向宿主的转移 GPI蛋白与细胞表面工程 体外GPI化蛋白可从一个细胞转移到另一 个细胞表面 细胞表面工程的步骤： – 把目的蛋白cDNA与GPI结合必需的C-端肽 cDNA融合表达，即可形成新的GPI化蛋白。

– 提取蛋白质与靶细胞保温，GPI蛋白即可自 动组装到靶细胞上 细胞表面工程的优点 制备较大量的GPI化蛋白 可在一些难以基因转染的细胞表面表达 目的蛋白 可对细胞表面蛋白进行修饰 多种GPI蛋白可以同时结合在一个细胞表 面 阵发性夜间血红蛋白尿症 (PNH) Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) ： 成人发病率1/105~106 是一种获得性溶血性贫血，其病因是细胞膜上 缺失十几种GPI化蛋白，如作为补体调节蛋白 的衰变加速因子(DAF)和补体C8的结合蛋白等 ，使红细胞对补体敏感性增加而产生红细胞溶 血 缺陷在于GPI生物合成的第一步，即GlcNAc向 磷酸肌醇转移这一步，相关的基因是磷脂酰肌 醇聚糖A(phosphatidylinositolglycan class A, PIG -A)基因 Haemoglobinuria: Urine passed 7am is dark containing a large amount of free haemoglobin which leaks out of PNH red-cells as they burst. The urine generally clears during the day. PNH患者的血尿症状 PNH机制 PNH的治疗 骨髓移植 补体抑制剂：Alexion制药公司(Cheshire, CN, USA)获得了美国食品药品管理局 (FDA)批准使 用Soliris (eculizumab)治疗PNH患者以降低溶血 。

扩增正常细胞：生长因子？ 25% of PNH patients survive >25 years - one half of these go on to spontaneous remission 将正常人红细胞释放的囊泡与PNH患者红细胞共置， 回流 造血干细胞基因治疗 思考题 GPI蛋白的结构组成？ GPI蛋白的生物合成过程？ GPI蛋白在细胞表面的锚定方式与糖蛋白 相比有什么优势？ GPI蛋白的分布和主要生物功能 GPI蛋。