第5章免疫血清学检验技术.ppt

第一节 凝集与沉淀反应第二节 放射免疫测定技术第三节 免疫荧光技术第四节 酶免疫测定第五节 固相膜免疫测定当前1页，共102页，星期日第一页，共一百零二页凝集反应： 细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象一、 凝集反应及其特点第一节 凝集与沉淀反应当前2页，共102页，星期日第二页，共一百零二页凝集反应过程：抗原抗体的特异性结合出现肉眼可见的凝集现象凝集反应特点：IgM的作用比IgG大数百倍IgG与抗原结合后，常不出现凝集现象，称不完全抗体临床意义：进行细菌的抗原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查未知血清的抗体当前3页，共102页，星期日第三页，共一百零二页多 克 隆 抗 体单 克 隆 抗 体肌红蛋白上清液当前4页，共102页，星期日第四页，共一百零二页肉眼可见的凝集现象当前5页，共102页，星期日第五页，共一百零二页直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象二、 直接凝集反应当前6页，共102页，星期日。

第六页，共一百零二页一）玻片凝集试验+ +方法评价:定性试验简便和快速敏感度低临床应用:菌种鉴定血清学分型血型鉴定当前7页，共102页，星期日第七页，共一百零二页二）试管凝集试验方法评价：半定量试验简便、快速敏感度低可有假阳性临床应用：肥达氏试验：伤寒副伤寒外裴二氏试验：斑疹伤寒Wright test:布鲁菌病交叉配血试验当前8页，共102页，星期日第八页，共一百零二页间接凝集反应(indirect agglutination)： 将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象载体种类：RBC（醛化）；聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化）；金黄色葡萄球菌三、 间接凝集反应当前9页，共102页，星期日第九页，共一百零二页用抗原致敏载体-检测抗体（一）间接凝集反应的类型1、正向间接凝集试验当前10页，共102页，星期日第十页，共一百零二页用抗体致敏载体-检测抗原2、反向间接凝集试验当前11页，共102页，星期日第十一页，共一百零二页用抗原致敏载体-检测抗原3、间接凝集抑制试验当前12页，共102页，星期日第十二页，共一百零二页coagglutination test：以金黄色葡萄球菌菌体为反应的载体。

人及多种哺乳动物（猪、兔、豚鼠等）血清中IgG抗体的FC段与菌体表面的A蛋白（SPA）非特异性结合后，IgG的两个Fab段仍然暴露在菌体表面，保持着结合抗原的活性和特异性当与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象SPA-(Fc)IgG(Fab)-AbSPA：staphylococcal protein A4、协同凝集试验当前13页，共102页，星期日第十三页，共一百零二页二）正向间接血凝试验血凝试验强度当前14页，共102页，星期日第十四页，共一百零二页1/21/21/41/41/81/81/161/161/321/321/641/641/1281/1281/2561/2561/5121/5121/10241/1024Pos.Pos.Neg.Neg.TiterTiter64648 8512512290% -半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂当前36页，共102页，星期日第三十六页，共一百零二页一、放射免疫分析1、基本原理：Ab限量，Ag*定量，Ag*与Ag具有等同的与Ab结合能力，且两者的总量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低，二者变化成函数关系。

当前37页，共102页，星期日第三十七页，共一百零二页当前38页，共102页，星期日第三十八页，共一百零二页以未结合的Ag*为F，Ag*-Ab复合物为B，则B/F或B/T(BF)与Ag的量变存在着剂量-反应曲线当前39页，共102页，星期日第三十九页，共一百零二页2、实验方法及测定Ag*Ag*AgAg平衡平衡非平衡非平衡一步法一步法二步法二步法AbAb体积温度时间pHAg*-标准；Ag-样品当前40页，共102页，星期日第四十页，共一百零二页二抗体沉淀法二抗体沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 试剂法试剂法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响 操作应简单、重复性好经济 结合与游离标记物的分离当前41页，共102页，星期日第四十一页，共一百零二页二、免疫放射分析1、基本原理：以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应, 用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单 当前42页，共102页，星期日第四十二页，共一百零二页2、单位点 IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合游离的标记抗体并将其分离, 测定上清液的放射量 当前43页，共102页，星期日。

第四十三页，共一百零二页3、双位点 IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性 当前44页，共102页，星期日第四十四页，共一百零二页RIARIAIRMAIRMA标记物抗原抗体原理竞争性结合非竞争结合反应体系Ag*、Ag、Ab固相Ab、Ab*、Ag反应动力学慢快灵敏度相对低高检测范围窄宽1-2数量级特异性差（PcAb）优（McAb）标准曲线结合率与测值成反比结合率与测值成正比待测抗原大小分子二抗原决定簇IRMA与RIA比较当前45页，共102页，星期日第四十五页，共一百零二页 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定第三节 荧光免疫技术（一）荧光免疫分析的基本原理当前46页，共102页，星期日第四十六页，共一百零二页均相荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定非均相荧光免疫测定荧光偏振免疫测定荧光免疫技术荧光免疫技术的类型荧光免疫测定液体样品测定荧光抗体技术固体样品测定直接法间接法双标记法当前47页，共102页，星期日。

第四十七页，共一百零二页荧光物质ex（nm）em（nm）应用异硫氰酸荧光素 (FITC)490495520530（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明 (RB200)570575595600（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC)550620（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560595（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354430（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340613时间分辨荧光免疫测定荧光免疫测定中常用的荧光物质 当前48页，共102页，星期日第四十八页，共一百零二页时间分辨检测原理示意图（二）时间分辨荧光免疫测定1、基本原理当前49页，共102页，星期日第四十九页，共一百零二页镧系元素铕(Eu3+)（最常用）；钐(Sm3+)；铽(Tb3+)；钕(Nd3+)；镝(Dy3+)荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA10002、标记物常见荧光物质的荧光寿命当前50页，共102页，星期日。

第五十页，共一百零二页3、信号增强作用结合-二酮体Eu3+解离pH4荧光增强Eu3+标记的抗原-抗体复合物固相双抗体夹心法原理示意图当前51页，共102页，星期日第五十一页，共一百零二页固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物在酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光4、双抗体夹心法当前52页，共102页，星期日第五十二页，共一百零二页待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比5、固相抗体竞争法当前53页，共102页，星期日第五十三页，共一百零二页待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比6、固相抗原竞争法当前54页，共102页，星期日第五十四页，共一百零二页荧光偏振免疫测定原理示意图 （三）荧光偏振免疫测定当前55页，共102页，星期日第五十五页，共一百零二页荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 酶标记抗体或抗原，与固相载体包被的抗原或抗体特异性结合洗去游离的酶标物加入底物，经酶分解后生成荧光产物。

四）荧光酶免疫测定当前56页，共102页，星期日第五十六页，共一百零二页标记酶底物荧光产物 ex(nm) em(nm) 响应信号碱性磷酸酶4-MUP4-MU36045010- 半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根过氧化物酶HPA二聚体3174140.03荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物 当前57页，共102页，星期日第五十七页，共一百零二页 固相抗体和酶标记抗体与待检抗原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比1、双抗体夹心法当前58页，共102页，星期日第五十八页，共一百零二页荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图 当前59页，共102页，星期日第五十九页，共一百零二页固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比 2、双抗原夹心法当前60页，共102页，星期日第六十页，共一百零二页待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比3、固相抗原竞争法当前61页，共102页，星期日。

第六十一页，共一百零二页抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)（五）荧光酶免疫技术的应用1、自身抗体检测当前62页，共102页，星期日第六十二页，共一百零二页寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌 )2、病原体检测当前63页，共102页，星期日第六十三页，共一百零二页肿瘤（人肝癌细胞）3、免疫病理检测当前64页，共102页，星期日第六十四页，共一百零二页4、细胞表面抗原和受体检测荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数 当前65页，共102页，星期日第六十五页，共一百零二页酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 第四节 酶免疫测定一、基本原理当前66页，共102页，星期日第六十六页，共一百零二页一）常用的酶及其底物1、辣根过氧化物酶（HRP）多用于ELISA方法四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性 2、碱性磷酸酶（AP）对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）经酶作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。

3、 - 半乳糖苷酶（-Gal）多用于均相酶免疫测定4MUG经酶作用后生成高强度荧光物，用荧光计测量当前67页，共102页，星期日第六十七页，共一百零二页。