IPTG-诱导表达.pdf

1 / 7 IPTG 诱导表达1.原核表达系统将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中高效地表达、合成基因产物的体系2.原核生物基因表达特点?原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子操纵子（ operon）是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位3.原核基因的表达调控原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上， 共同组成一个转录单位操纵子（元） ，如乳糖（ lac）操纵子 、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操纵子（元）等操纵子（元）机制在原核基因调控中具有较普遍的意义4.乳糖（ lac）操纵子（元）调节机制糖操纵子4.乳糖操纵子的结构5.阻遏蛋白的负性调节?阻遏蛋白的负性调节在没有乳糖存在时，lac 操纵子 （元） 处于阻遏状态 此时，I 序列在 P 启动序列操纵下表达的Lac 阻遏蛋白与O 序列结合，阻碍RNA 聚合酶与 P 序列结合，抑制转录起动当有乳糖存在时，lac 操纵子（元）即可被诱导在这个操纵子（元）体系中，?真正的诱导剂并非乳糖本身乳糖进入细胞，经b半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O2 / 7 序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定. 6.乳糖操纵子的结构及阻遏作用7.外源基因在原核表达系统中表达的必要条件1.删除内含子和5 非编码区2.外源基因置于强启动子和SD 顺序控制下3.维持正确开放阅读框架（ORF）4.mRNA 稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解8.影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子2、基因剂量3、核糖体结合位点9.常见原核强启动子?Plac：受 Lac 阻遏蛋白负调，受IPTG 的诱导?Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子Ptac :Lac 启动子和Trp 启动子的杂合启动子PL和 PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子， 受噬菌体CI 基因负调控 温度诱导10.原核表达载体适用于在原核细胞中表达外源基因的载体pET 系列质粒及PGEX-4T主要元件：强启动子、SD 顺序、筛选标志、其它调控基因11.IPTG 诱导 PGEX -4T-2 重组质粒的表达3 / 7 原核表达载体PGEX-4T 带有一个“ tac ”强启动子，载体上还携带Laclq 基因，编码Lac 抑制因子，当无 IPTG 存在时，Lac 抑制因子能抑Ptac转录，保持低水平表达。

加入诱导物IPTG时它可与阻抑物结合，导致阻抑物构象变化，起到去阻抑作用，起动转录，高效表达12.IPTG 诱导 pET 系列重组质粒的表达13.原核蛋白融合表达优点?表达效率高?产物稳定?易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定4 / 7 ?易纯化：利用融合原核多肽的特性14.实验原理蛋白质表达是为获得大量的目标蛋白质而进行的有目的性的蛋白质合成常用方法是将编码所需产物的基因插入质粒或其他载体，然后将该载体导入活细胞，进行大量合成大多数克隆载体都以大肠杆菌作为宿主因为大肠杆菌具有两个特征：操作简易和能在廉价的培养基上迅速的生长在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入表达载体（一般是质粒）载体应具有的几种元件有：选择标志的编码序列，它可供筛选以确定载体是否进入了细胞；可控转录启动子，经诱导后从克隆化基因产生大量的mRNA ；转录调控序列，如一个合适的核糖体结合位点和起始密码子ATG；一个多限制酶位点接头，便于外源基因以正确方向插入载体中我们将含有待表达基因的PGEX -4T 载体的大肠杆菌DH5a 接种于培养基中，培养至对数生长期，加入IPTG 诱导目的基因的表达并用SDS-PAGE 对实验结果进行观察。

14.实验步骤14.1 融合蛋白的表达（1）重组表达质粒转化DH5 感受态细胞2）分别挑取单菌落接种于5 ml LB ( 0.1 gL-1氨苄青霉素 )中， 37培养过夜3）以 2 %体积比转接于200 ml LB( 0.1 gL-1氨苄青霉素 )中， 37继续培养2.5 hr，至细菌对数生长期，加0.1 mmol/L IPTG 200 l诱导 3-4 hr4）12,000 rpm 离心 10 min 收取菌体沉淀14.2 小量融合蛋白的诱导表达（1）重组表达质粒转化DH5 感受态细胞2）分别挑取单菌落接种于5 ml LB ( 0.1 gL-1氨苄青霉素 )中 ,37培养过夜3）以 2 %体积比转接于2 ml LB( 0.1 gL-1氨苄青霉素 )中， 37继续培养2.5 hr，至细菌对数生长期，加0.1 mmol/LIPTG 2 l诱导 3-4 hr，同时设立不加IPTG 诱导作为对照4）取 1 ml 菌液 ,12,000 rpm 离心 10 min 收菌体沉淀5） 重悬于冰的100 l PBS中，加入 PMSF 至终浓度为10mmol/L. 震荡器震荡混匀，加入 2加样缓冲液，煮沸10min 变性， 12,000 rpm 离心 10 min。

6）分别取诱导前和诱导后的样品10 l进行 SDS-PAGE 电泳分析（ 9-12%） 14.3 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE附：IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y 及 A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、 一个启动序列P及一个调节基因I I 基因编码一种阻遏蛋白，后者与 O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态在启动序列P 上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP ）结合位点由P序列、 O序列和 CAP结合位点共同构成lac 操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达在没有乳糖存在时，lac 操纵子（元）处于阻遏状态此时，I序列在 PI 启动序列操纵下表达的Lac 阻遏蛋白与 O序列结合， 阻碍 RNA聚合酶与 P序列结合， 抑制转录起动当有乳糖存在时，lac 操纵子（元）即可被诱导在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身 乳糖进入细胞， 经 b半乳糖苷酶催化， 转变为半乳糖 后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，5 / 7 使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria Bertani）) 培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液： 2 g IPTG 溶于 10 mL 蒸馏水中， 0 . 22 m 滤膜过滤除菌，分装成1 mL / 份， 20 保存 3 ) l 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级）0.1 溴酚蓝10 甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI （2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（ PMSF ）3）10 mg / mL 溶菌酶。

6 / 7 （4）脱氧胆酸5）1 mg / mL DNase I2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液 2 ) 2SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2 溴酚蓝20 甘油实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因 2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌 3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，确定无误后进行下一步 4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 培养数小时，使培养液的OD600达 0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 继续培养 3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则 37 培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L继续培养3 -5h 5 ）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加 100 L 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作 SDS -PAGE 检测。

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1 ）细菌的裂解常用方法有：高温珠磨法；高压匀浆；超声破碎法；酶溶法；化学渗透等前三种方法属机械破碎法，并且方法、 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤7 / 7 （1）酶溶法常用的溶解酶有溶菌酶；-1,3 -葡聚糖酶； -1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著主要步骤为： 4 ，5000rpm 离心， 15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀文档可能无法思考全面，请浏览后下载，另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意!。