基于伴随标志物在线控制技术的绞股蓝总皂苷纯化工艺及成分鉴定研究.docx

    基于“伴随标志物”控制技术的绞股蓝总皂苷纯化工艺及成分鉴定研究    范冬冬 匡艳辉　董利华　叶潇　陈两绵　张东　马振山　王锦玉　朱晶晶　王智民　王德勤　李楚源[摘要] 基于“伴随标志物”紫外检测技术以绞股蓝总皂苷（GPS）为目标，优化绞股蓝中GPS的纯化工艺，采用UPLCQTOFMS技术对GPS进行定性伴随标志物”紫外检测研究表明，上样终点为流出液吸光度为原药液的1/2时，洗脱终点为洗脱流出液吸光度基本稳定UPLCQTOFMS鉴定出GPS提取物中的16个皂苷，其中新皂苷3个该研究优选出的纯化工艺简单、检测方便、易于测定、实时记录，能较好的运用到大生产或生产的自动化中质谱定性鉴定结果表明，基于“伴随标志物”紫外检测技术能很好地保留药材中的主要药效成分，为过程控制和质量溯源提供了分析工具[关键词] 绞股蓝总皂苷； 纯化； 大孔吸附树脂； 伴随标志物； 检测； UPLCQTOFMSPurifying process of gynostemma pentaphyllum saponins based on"adjoint marker" online control technology and identification oftheir compositions by UPLCQTOFMSFAN Dongdong1，2， KUANG Yanhui3， DONG Lihua 2， YE Xiao 1，2， CHEN Liangmian2， ZHANG Dong 2，MA Zhenshan2， WANG Jinyu2， ZHU Jingjing2*， WANG Zhimin2*， WANG Deqin3， LI Chuyuan3（1. Shaanxi University of Chinese Medicine， Xi′an 712046， China；2. National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Institute ofChinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；3. Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Co.， Ltd.， Guangzhou 510515， China）[Abstract] To optimize the purification process of gynostemma pentaphyllum saponins （GPS） based on "adjoint marker" online control technology with GPS as the testing index. UPLCQTOFMS technology was used for qualitative analysis. "Adjoint marker" online control results showed that the end point of load sample was that the UV absorbance of effluent liquid was equal to half of that of load sample solution， and the absorbance was basically stable when the end point was stable. In UPLCQTOFMS qualitative analysis， 16 saponins were identified from GPS， including 13 known gynostemma saponins and 3 new saponins. This optimized method was proved to be simple， scientific， reasonable， easy for online determination， realtime record， and can be better applied to the mass production and automation of production. The results of qualitative analysis indicated that the "adjoint marker" online control technology can well retain main efficacy components of medicinal materials， and provide analysis tools for the process control and quality traceability.[Key words] gynostemma pentaphyllum saponins （GPS）； purification； macroporous absorptive resin； adjoint marker； online detecting； UPLCQTOFMS絞股蓝Gynostemma pentaphyllum （Thumb.） Makino为葫芦科多年生草质藤本植物，有“南方人参”和“第二人参”的美誉，别名小苦药、公罗锅底、五叶藤、遍地生根，在日本民间称“甘茶蔓”[12]。

早在我国明代《救荒本草》中已有记载，绞股蓝性寒味甘，具有清热解毒、补气生津、祛痰止咳、安神固精之功绞股蓝中主要活性成分为达玛烷型皂苷类成分，且含量较高；它具有保护心脑血管、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、调血脂、保肝、抗氧化、抗溃疡以及抗衰老等多种活性[3] 绞股蓝药材品种来源较为混乱，不同产地同一品种、不同种植品种、不同药用部位等，其皂苷含量及成分都存在很大差异，也许是迄今药典尚未法定标准的难点所在据悉绞股蓝皂苷（GPS）提取物原料生产商使用的是根，而部颁标准WS3Z00693（Z）指定使用部位為全草；全草和根的成分存在很大差异，加上缺乏对照品，致使很多企业难以复制出其生产工艺纯化皂苷的工业化常规手段是大孔吸附树脂法，实际生产中往往主要依赖经验的终点放行模式，或辅助旁线或离线手段（TLC法和分光光度法测定皂苷），加上对GPS的含量要求较高（要求“总皂苷≥80%”），实际生产中往往难以实现不间断生产，甚至不得不反复纯化，这样又可能导致其次生皂苷成分的生成而致成分更复杂，生产的重复性和质量的均一性很难保证，同时也难以实现生产的自动化和连续化为解决该问题，以洗脱液的旁线检测（TLC检测成分、UVVIS测定皂苷和含固量的测定）为指标为指示，设计并建立洗脱液中“伴随标志物”（有UV吸收者）与皂苷（无UV吸收）间的关系，并以伴随标志物的吸光度作为快速判断过程监测和终点放行的指标，实现对皂苷类成分在纯化过程的“替代”控制和实时监测。

本研究以绞股蓝皂苷为对象，基于“伴随标志物”的紫外检测，实现对无紫外吸收皂苷的过程控制，为工业化连续生产提供了一种简单易行、准确可靠的检测技术；同时对纯化得到的GPS进行主成分定性分析，以保障原料与成品间质量的可溯源性1 材料梅特勒精密电子天平（XS105DU）；紫外可见分光光度计（T6新世纪）；N1100型EYELA旋转蒸发仪（上海安亭科学仪器制造）；SB1100 EYELA水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵（河南省予华仪器有限公司）；TGL16G台式离心机（上海安亭科学仪器制造）；KQ250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Xevo G2S QTOF质谱仪（美国Waters公司）；配有Lockspray 接口，电喷雾离子源（ESI），MassLynx4.1质谱工作站；ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱（Waters公司）绞股蓝皂苷XLIX对照品（纯度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；甲醇、乙醇、冰乙酸、高氯酸（分析纯）、石油醚（分析纯）、Fisher 乙腈、甲酸（质谱纯）、5%香草醛冰乙酸溶液；HPD100，HPD200，HPD300，HPD400，HPD500，NKAⅡ大孔吸附树脂（河北沧州宝恩化工）；SP825L（北京绿百草）；绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝的干燥地上部分，实验用样品为福建漳州绞股蓝的叶子，品种鉴定经叶华谷研究员鉴定为绞股蓝G. pentaphyllum。

2 方法与结果2.1 绞股蓝总皂苷的测定2.1.1 对照品溶液的制备精密称取绞股蓝皂苷XLIX对照品10.00 mg于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为2.00 g·L-1的溶液2.1.2 供试品溶液的制备精密称取绞股蓝总皂苷10.00 mg，置2 mL离心管中，加石油醚2 mL，超声处理10 min，6 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，残渣挥干，加甲醇分次溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取部分6 000 r·min-1离心10 min，得供试品2.1.3 标准曲线的绘制精密吸取绞股蓝皂苷XLIX对照品溶液（2.00 g·L-1）10，20，40，60，80，100 μL分别置15 mL具塞试管中，挥干，精密加入新配制的5%香草醛冰乙酸溶液与高氯酸（2∶8）的混合液2 mL，摇匀，密塞，置60 ℃水浴中加热15 min，立即放入冷水中冷却至室温，分别精密加冰乙酸10 mL，摇匀，以试剂作空白，按照紫外可见分光光度法（《中国药典》2010年版一部附录VA）试验，在550 nm的波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、以质量（X）为横坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方程Y=1.088 4X-0.003 3，r=0.999。

结果表明，取样量在0.01～0.20 mg 有良好的线性关系2.1.4 绞股蓝总皂苷含量测定方法精密量取供试品200 μL置15 mL具塞试管中，挥干甲醇后按2.1.3项下操作，测定吸光度，用标准曲线计算出绞股蓝总皂苷的质量2.2 大孔吸附树脂型号筛选2.2.1 大孔吸附树脂静态吸附和解吸实验考察2.2.1.1 大孔吸附树脂预处理 7种不同型号大孔吸附树脂（HPD100HPD500，SP825L，NKAⅡ）分别用95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀，用乙醇洗至溶液加适量蒸馏水无白色浑浊现象时为止，最后用去离子水洗至无醇味，备用2.2.1.2 静态吸附和解吸 30%乙醇回流提取2次，料液比为1∶8，每次提取1.5 h，合并提取液，减压浓缩至生药含量0.1 g·mL-1即为提取液称取各型号经预处理的树脂5 g（湿质量）置于100 mL锥形瓶中，各加入绞股蓝提取液50 mL，持续振摇30 min，静置12 h后，抽滤，得吸附后的滤液将吸附后的各型号树脂滤出后分别另置100 mL锥形瓶中，各加入95%乙醇50 mL，其余操作同上，得解吸后的滤液精密量取吸附后的滤液100 μL、原料液30 μL和解吸后的滤液50 μL置15 mL具塞试管中，挥干后按2.1.3项下操作，测定吸光度，由标准曲线方程求得绞股蓝总皂苷含量。

单位树脂饱和吸附量=（原料液总皂苷质量-吸附后滤液总皂苷质量）/湿树脂的量；解吸率=解吸后的滤液总皂苷质量/饱和吸附量×100%根据以上公式计算每种树脂对总皂苷的静态饱和吸附量及解吸率（原料液总皂苷质量为244.78 mg），结果见表1 由表1可见，。