当归对宫内缺氧后新生大鼠大脑CA3区神经元及NMDAR1mRNA表达的影响药学论文.doc

当归对宫内缺氧后新生大鼠大脑CA3区神经元及NMDAR1mRNA表达的影响_药学论文 作者：陈旭东 ，赵四敏， 华新宇， 余鸿【摘要】 　　目的探讨当归对宫内缺氧后新生大鼠大脑内N-甲基D-天冬氨酸受体亚单位NR1 (NMDAR1 mRNA)表达及神经元的影响方法将孕期14d的SD大鼠随机分为对照组、缺氧组和当归 治疗 组缺氧组孕鼠自孕第14天开始每天1次经尾静脉注射生理盐水8 ml/kg（连续7 d），后用低张性缺氧模型致胚鼠宫内缺氧2 h（连续3 d：孕期第14天、15天、16天）；当归治疗组用250 g/L的当归注射液代替生理盐水，其余处理同缺氧组；对照组不缺氧，其余同缺氧组三组孕鼠分娩当日取脑组织、多聚甲醛固定，石蜡包埋切片NSE免疫组化、NMDAR1原位杂交神经元DAB显色、400倍拍照、IPP6.0软件图像分析结果缺氧组新生鼠NSE阳性细胞表达较对照组减少 (P＜0.05)，而NMDAR1 mRNA的表达较对照组增加 (P＜0.05)；当归组NSE阳性细胞表达较缺氧组增加 (P＜0.05)，而NMDAR1 mRNA的表达较缺氧组减少 (P＜0.05)结论当归注射液对宫内缺氧新生大鼠脑组织具有保护作用，其作用机制之一可能是与抑制NMDA R1 表达有关。

【关键词】 当归； 缺氧； 脑； NMDAR1　　宫内缺氧是影响胚胎发育的常见因素，也是导致新生儿残疾和死亡的主要原因之一然而，损伤后的神经系统能否及时修复、如何修复等显得非常重要本小组前期研究表明当归可减弱缺氧时神经元的变性［1］，但是其机制如何？近年来研究发现，NMDA受体是兴奋性氨基酸的特异性受体，也是兴奋毒性的主要神经通路，从而发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用但NMDA是否也参与宫内缺氧新生大鼠的神经系统的改变，其又扮演了怎样的角色？本实验试图建立在体宫内缺氧模型，预观察神经元的和NMDA的变化，以及当归对其是否有调控作用并探讨其可能机制　 　1 材料与方法 　　1.1 材料小鼠抗NSE（CHEMICON公司）、NMDAR1原位杂交检测试剂盒、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(棕黄色) 购自武汉博士德生物工程公司；250 g/L的当归注射液购自武汉大学附属第二 医院 药剂科（批号：070823）；OLYMPUS Bx-70荧光显微镜成像系统为日本OLYMPUS光学仪器有限公司生产；德国莱卡切片机；三气培养箱（购自美国REVCO公司）SD大鼠15只（220～250g）由泸州医学院动物实验中心提供。

　　1.2 动物配种与分组成年健康SD雌大鼠15只(体质量220～260 g)，分别与SD雄鼠合笼配种，次日晨见阴栓记为大鼠怀孕0d，孕鼠随机分为对照组、缺氧组、当归组各5只　　1.3 宫内缺氧模型建立当归组孕鼠自孕14 d开始，每天上午8：00经尾静脉注射250 g/L的当归注射液8ml/kg（孕14～20 d，连续7 d），1 h后放入三气培养箱(氧体积分数130 ml／L，温度25℃ ，二氧化碳体积分数0.4～0.6 ml／L)内缺氧2 h，连续缺氧3 d(孕第14～16天)，第17天、18天、19天、20天仍给予当归注射，但不缺氧缺氧组用生理盐水代替当归注射液，其余同当归组对照组不缺氧，余同缺氧组　　1.4 取材、石蜡切片及NSE免疫组织化学和NMDAR1原位杂交测定每只孕鼠分娩当天随机选取新生大鼠2只 ，每组得新生鼠10只， 取新生大鼠脑、40 g／L多聚甲醛固定60 min、常规石蜡包埋（试剂中均含1 ml/L的DEPC）、经海马冠状切面切片(厚4 μm)脑组织切片作NSE免疫组化、NMDAmRNA原位杂交（步骤按说明书进行），切片常规脱水、透明、封片采用OLYMPUS Bx-70荧光显微镜成像系统拍照，经Image-Pro Plus5.1图像分析系统对阳性细胞进行图像分析。

　　1.5 统计学处理各组间比较用方差分析，两两比较用LSD法检验采用SPSS15.0软件包完成数据分析（P<0.05）　　 2 结果 　　2.1 各组新生鼠脑CA3区NSE免疫组化染色结果对照组NSE免疫组化阳性细胞分布于锥体细胞层，分子层，多形细胞层，胞质染为棕黄色（见图1）；与对照组相比缺氧组阳性细胞染色减弱，数量减少（见图2）；与缺氧组相比当归治疗组阳性细胞染色增强，数量增多（见图3），各组积分光密度值见表1表1 各组新生大鼠NSE和NMDAR1mRNA阳性细胞IOD值（略）　　2.2 各组新生鼠脑CA3区NMDAR1 mRNA原位杂交结果NMDAR1 mRNA原位杂交阳性细胞分布在锥体细胞层，分子层，多形细胞层，胞质染为棕黄色，对照组阳性细胞浅染，数量少（见图4）；缺氧组阳性细胞染色明显增强，数量较对照组增多（见图5）； 当归组阳性细胞染色较相应缺氧组减弱，数量减少（见图6），各组积分光密度值见表1 　　 　3 讨论　　由于众多因素（如母体因素、脐带因素、胎儿因素等）的普遍存在，导致宫内缺氧的发病率较高，而且神经系统（尤其海马）是对缺氧损伤极为敏感的部位之一,可造成不同程度的脑组织损伤, 因此，宫内缺氧必然影响到胚胎海马神经元的生长发育，而神经元仅能生长没有分裂能力，故研究如何有效地挽救受损神经元有着重要意义。

　　胚胎时期神经元主要来源于神经干细胞的增殖和定向分化［2］，而神经干细胞的增殖受自身基因调控和外来信号调控两种机制的影响氧浓度降低，复杂的细胞内氧感受系统迅速感受氧分压的变化，诱导适应性机制的出现，以最大程度地减少低氧对脑的损伤其中关键性调节因子是低氧诱导因子HIF-1，它诱导多种基因表达，需要指出的是，神经系统对低氧最敏感，即使有HIF-1的调节，轻度低氧也可能影响神经元功能［3］本实验中，观察到缺氧3 d（每天2 h）组新生大鼠免疫组化NSE表达比对照组减弱、阳性细胞减少，积分光密度值减小，说明胚胎海马的神经元出现了坏死和凋亡，导致神经元数量减少，经神经干细胞分化、补充，经缺氧后7 d的补充修复，到出生时神经元数量仍然明显少于对照组而当归治疗组新生鼠大脑NSE免疫反应阳性细胞的积分光密度值较相应缺氧组增多， 说明当归注射液减弱了缺氧对神经元的损伤，起到了保护作用　　研究表明NMDAR是一种谷氨酸盐受体，在全脑都有分布，但密度最高的是海马CA1区，CA3区和齿状回为中等水平，NMDAR1 mRNA是一种特异性离子型受体，Vicin等［4］发现NMDA受体至少有7个亚单位，即NMDA受体1（NR1），4种NMDA受体2（NR2），2种NMDA受体3(NR3)，而NR1亚单位对NMDA受体通道功能是必需的［5］，NMDA受体通道在学习记忆中开启和学习记忆、神经元可塑性及大脑发育等方面均起重要作用［6］。

目前认为它是介导神经毒性最主要的受体［7］NMDA受体通道对Ca2+高度通透，谷氨酸等神经递质使受体激活，离子通道开放，阳离子如Ca2+ 、Na、K可进出细胞，使细胞膜去极化和神经元兴奋［8］，Rice等［9］研究表明，谷氨酸通过NMDA受体1在缺血缺氧所致的神经元损伤中起关键作用谷氨酸(L-glutamic acid，GLU)是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质，其受体在调节学习记忆的过程中起着重要作用，其中离子型受体NMDA被认为是影响学习记忆的关键物质NMDA受体广泛分布于中枢神经系统，尤以海马区最丰富临床已证实NMDA受体与脑缺血缺氧、低血糖、癫痫、外伤性脑损伤密切相关［10］，本实验在检测NMDAR1 mRNA时发现，缺氧组NMDAR1 mRNA较对照组增多，而当归组NMDAR1 mRNA较缺氧组减少，说明缺氧可以使NMDAR1 mRNA表达增加，而当归可减弱NMDAR1 mRNA的表达，结合NSE的结果，可以推断在缺氧损伤时NMDAR1 mRNA可明显增高，神经兴奋毒性增强，导致大量神经元坏死或凋亡从而NSE表达减少，运用当归后NMDAR1 mRNA的表达较缺氧组减少，神经兴奋性毒性减弱从而起到神经保护作用。

　　综合以上实验结果表明，当归注射液可以发挥程度不同的降低受体结合力的能力，即抑制NMDA受体的活性，提示当归在保护损伤神经及促神经再生方面有重要作用，因此当归可能参与抑制兴奋性氨基酸毒性作用当归是国药精华，专能补血，研究发现当归含有挥发性和水溶性两大类成分，作用广泛，对升高子宫组织中一氧化氮水平、降低钙离子水平明显缓解痛经［11］当归成分具有高活性的神经保护作用，对谷氨酸受体引起的神经损伤有保护作用，还能明显减少过度活化的谷氨酸受体引起Ca2+的内流， 通过对以上当归的药 理学 方面综合分析，当归一方面可以通过扩张血管、改善循环，增加子宫及脐带供血；另一方面，可以缓解平滑肌痉挛，减低子宫的反应性；另外，还可以通过清除自由基、抗脂质氧化能力等途径起作用，且当归的缓解、保护理论，也为以后的宫内缺氧临床预防与 治疗 提供依据 【 参考 文献 】 　　［1］陈旭东，岳鹤声，刘红敏，等.宫内缺氧对新生大鼠神经元的影响及当归的保护作用［J］.时珍国医国药，2009，20（9）：2327.　　　　　［2］Bourdeaut F,Ribeiro A,Paris R,et al.In neyroblastic tumours,Schwann cells do not harbour the genetic alterations of neuroblasts but may nevertheless share the same clonal origin［J］.Oncogene.2008，27(21):3066.　　［3］Zhou L,Del Villar K,Dong Z,et al.Neurogenesis response to hypoxia-induced cell Death：map kinase signal transduction mechanisms［J］.Brain Res,2004，1021(1):8.　　［4］Vicin S,Wang JF，Li JH，et al.Functional and pharmacological differences between recombinant N-methyl-D—Aspartate receptors［J］.J Neurophysic，2003，79：555．　　［5］Luo J，BosyTZ，WangY，et a1．Ontogeny of NMDAR1 subunit protein expression in five regions of rat brain［J］．Brain Res Develop Brain Res．2006，92：10.　　［6］岳志军，邢 伟. 铝暴露对海马NMDA受体的影响［J］.解剖 科学 进展，2008，14(4)：429.　　［7］Sumki Y，Takagi Y，Nakanluro B，et a1．Ablity of NMDA and nonnmda receptor antagonists to inhibit cerebral iachemia damage in rats［J］．Bain Bes，2003，964：116.　　［8］Malenka RC，Nicoll RA．Long-term potentiation-A decade of progress［J］．Science，1999，285(5435)：l870．　　［9］Rice AG，Delorenzo Pd．NMDA receptor activation during status epilepticus is required for the development for epilepsy［J］．Brain Res，1998，782(1～2)。