基因型鉴定 中科院版.docx

1. 鼠尾 DNA 提取第一天：1. 剪取小鼠尾尖（同样适用于脚趾，胚胎组织，卵黄膜等，若不立即提取，可以 放置4°C数日）放入1.5ml EP管2. 每管加入鼠尾裂解液350ul +10ul蛋白酶K （简称PK, 10mg/ml，现用现加）3. 55 C水浴消化过夜第二天：4. 用劲将消化好的组织摇匀（可用振荡器摇匀）5. 每管加入350ul酚/氯仿（苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，事先配好，4C保 存）6. 上下充分混匀，室温静置 3 分钟后，离心， 12000 转， 30 分钟7. 取出离心后的EP管，可见液体分为三层，取上层无色水相液体约200^1于新 1.5ml EP 管中，注意勿吸取中层液体不能将中间的蛋白层吸起来，否则会 对后续的实验造成影响为防止压力过大，可使用切去尖端的枪头）8. 向新EP管中加入400^1无水乙醇（为2倍于上清的体积），上下颠倒混匀，此 时应可看到白色丝状样的 DNA9. 离心 12000 转， 10 分钟10. 可看到有白色沉淀，弃去上清，加入1ml的75%乙醇，将沉淀弹起，以便去除 DNA 上过多的离子11. 离心， 12000 转， 10 分钟。

12. 弃去上清，倒置 EP 管于吸水纸上，室温干燥约 15 分钟（注意不能过分干燥，以免 基因组DNA难溶解）13. 加入150-200^1（根据DNA沉淀的量）无菌蒸馏水或者是TE Buffer，可放置37C助溶14. 短期4C，长期-20C保存相关配方：1. 鼠尾裂解液配方1000ml 溶解液中含：100mM Tris-HCl pH8.55mM EDTA0.2%SDS200mM NaCl室温保存2. 蛋白酶 K 溶液：取100mg蛋白酶K，加去离子水10ml使成10mg/ml，分装后冻存于 -20C，用时溶解3. 酚/氯仿：取Tris平衡酚50ml，氯仿48ml，异戊醇2ml加入100ml棕色试剂瓶中 混 匀，4C避光保存2. 基因鉴定PCR反应标准的 PCR 反应体系：10x扩增缓冲液4 种 dNTP 混合物 引物模板 DNATaq DNA 聚合酶Mg2+ 加双或三蒸水至10ul各 200umol/L各 10 〜100pmol0.1 〜2ug2.5U1.5mmol/L100ul以我们实验室常用的 PCR25ul 体系为例：10xbuffer：2.5uldNTP2ulMgCl2：1.5ulPrimer F：1ulPrimer R：1ulTaq 酶：0.5ulDNA 模板：1~3ul去离子水加至：25ul退火温度根据引物合成说明书决定PCR 操作注意事项：1) PCR 的复合管配制需在冰上进行，尤其 taq 酶需始终放于冰上，或者在最后加入时 从-20°冰箱拿出，加完后立即放回。

2) PCR 反应极为灵敏，操作过程应当注意避免样本之间的相互污染， 吸取不同样本时应 当换枪头3. 琼脂糖凝胶电泳1. 根据欲分离DNA片断大小用凝胶缓冲液（TAE缓冲液）配制适宜浓度的琼脂糖凝胶， 以1%胶为例：称取琼脂糖1克，倒入通风橱内的锥形瓶中，尽量不要让粉末沾在内壁 上用量筒量取IXTAEIOOml，倒入锥形瓶，戴入一次性手套混匀2. 戴一次性手套把锥形瓶放入微波炉，加热3min左右，使琼脂糖彻底溶解，看不到颗粒 为止在此期间插好制胶的板槽和梳子3. 迅速将锥形瓶置于通风橱内，冷却片刻，用通风橱内20“1枪，吸6~10ul （0.05%）的 EB，插入液面，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，注意避免产生气泡， 如有气泡，应设法除去枪头应丢入指定垃圾箱）4. 等待 30min 冷却5. 凝固后，戴一次性手套，先两端起开一点梳子，再将梳子完全拔出，将胶安放在电泳 槽内6. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法 除去退掉一次性手套加样7. 每个25ul样本加入6X buffer 5ul，混匀后，将样品缓冲液缓慢加入被浸没的凝胶加样 孔内。

8. 加样后带上一次性手套接通电源，插上+/ -极，切记 DNA 样品由负极往正极泳动 设置电压，一般为60-100V，按下RUN开始电泳，电泳15-30分钟即可9. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；一般前端染料到2/3处即可10. 电泳完毕后，戴一次性手套关掉电泳仪拿出胶版，推出胶在凝胶成像仪上观察电 泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,000-30,0000.7%800 ~ 12,0001.0%500 ~ 10,0001.2%400 ~ 7,0001.5%200 〜3,0002.0%50 〜2,000。