纳豆菌固态产酶条件的优化.doc

纳豆菌固态产酶条件的优化摘 要 实验采用单因素试验优化纳豆菌固体发酵条件，通过蛋白凝块溶解时间法测定纳豆激 酶活力，筛选 出最佳培养条件固态发酵通过扎孔、添加麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和黄豆粉观察它们对纳豆 菌产酶活力的影 响试验结果表明: 固态发酵最佳条件为，浸泡 10 h 后，扎孔、添加 4%麦芽糖、4%黄豆粉， 121 ℃下蒸煮 30 分 钟，接入纳豆菌 2%，在 37 ℃下培养 24 小时，4 ℃下后熟 24 小时在此条件下培养，测 得的纳豆激酶活力相当 于尿激酶 943．23 IU/g与先前实验结果相比有了明显的提高:固态发酵由 670．15 IU/g 提高到 943．23 IU/g 关键词 纳豆; 纳豆激酶; 纳豆菌; 发酵Abstract The solid fermenting conditions of Bacillus subtilis natto were confirmed in single factor experiments，the activity of Nattokinase was measured through the method of fibrin liquefied time，and the optimal fermenting conditions of Bacillus subtilis natto were filtrated out． Several methods were utilized to the ferment process． Then the activity of Nattokinase was measured， such as pricking holes，and appending maltose，sucrose，glucose and soybean powder． The optimal conditions of solid fermenta- tion were: soaking the soybean in water for 10 h，pricking holes，adding in 4% maltose and 4% soybean powder，steaming the mixture at 121 ℃ under high pressure for 30 minutes，inoculating into the mixture with 2% Bacillus subtilis natto，and fermen- ting it at 37 ℃ for 24 h． Afterripening the materials at 37 ℃ for 24 h． Cultivating them in this condition，the activity of Nattokinase com- pared with Urokinase was 943． 23 IU/ g． In contrast to the previous results，the activity was enhanced from 670． 15 IU/ g to 943． 23 IU/ g by using solid fermentation．Key words Natto; Nattokinase; Bacillus subtilis natto; Fermentation 纳豆( Natto) 是日本一种历史悠久的发酵大豆食品， 其独特的味道是由一种特殊品系的枯草杆菌 ( Bacillus subtilis) 或纳豆芽孢杆菌 ( Bacillus natto) 发酵大豆产 生 ［1］ 。

纳豆作为食品以其丰富营养、多样的生理调节机 能以及神秘的药效而闻名于世，世界各国对纳豆及其生 理调节有效成分的研究方兴未艾本论文在先前研究的 基础上，进一步研究纳豆菌固态的产酶条件，筛选出最佳 培养条件，为纳豆激酶的进一步研究奠定了基础 1 实验材料与方法 1． 1 试验原料优质大豆 ( 湖北产) Bacillus stubtilis natto ( 天津市百德生物工程有限公司) 1． 2 主要实验仪器 WS2 － 134—75 型电热恒温培养箱 ( 上海市跃进医疗器械一厂) THZ － 82 水浴恒温振荡器 ( 金坛市华峰仪器有限公司) 8302 型恒温水浴锅 ( 巩义市英峪予华仪器厂) 1． 3 主要实验药品与试剂 酵母膏( 生化试剂) 北京奥博星生物技术公司 蛋白胨( 生物试剂) 武汉市第二生物化学制药厂 麸皮( 食用级) 调味食品厂黄 冈 师 范 学 院 学 报 第 31 卷 牛肉膏( 生物试剂) 北京微生物培养基制品厂 牛凝血酶( 生化试剂) 中国药品生物制品检定所 其他药品均为国产分析纯 1． 4 实验原理及方法 1． 4． 1 纳豆激酶活性测定原理及方法 本实验采 用纤维蛋白凝块溶解时间法( CLT 法) ［2］ 测定纳豆激酶活 力。

其原理是: 纤维蛋白原在凝血酶作用下形成纤维蛋 白，试管中溶液凝聚为胶状; 激酶将纤维蛋白溶酶原激活 为纤维蛋白溶酶，溶解纤维蛋白，胶体底部开始溶解并伴 随气泡向上移动，根据气泡移动的时间来确定激酶的纤 溶活性 1． 4． 2 纳豆菌分离培养的原理及方法 分离培养 是在一定条件下( 如: 从自然界中获得新种，从生产中选 育高产菌种，或是从污染的菌种中重新获得纯种等) ，将 一种微生物从微生物的群体中分离出来，并进行培养、获 得纯种，在实际操作中经常使用 1． 4． 3 纳豆菌固态产酶条件的优化 ( 1) 固态发酵工艺原料大豆 → 精选 → 洗涤 → 浸 泡( 加入 3 倍清水浸泡约 10 h，浸泡后大豆增重为原重的 2． 2 ～ 2． 3 倍) → 分装( 100 ml 锥形瓶装入 20 g 大豆)→ 蒸煮、灭菌( 121 ℃，20 min) → 冷却 → 接种( 接菌量2% ) → 发酵( 37 ℃，24 h)→ 后熟( 4 ℃，24 h) → 成熟 纳豆( 2) 固态发酵酶液提取取纳豆 2 g，加入 0． 9%生理 盐水 40 ml，置于冰箱中约 1 小时，滤出液体，离心( 4000 r / min) 10 min，取上清备用。

( 3) 固态发酵条件的优化根据对大豆成分和固态 发酵的分析，进行以下实验: 1． 通过扎孔使菌液与培养基的接触更加充分 表 1 扎孔、加糖对产酶活力的影响 反应时间( s) 稀释 倍数 酶活力( IU/ml) 空白 422 60 797． 13 扎孔 339 60 1279． 25 加糖 293 60 1761． 04 扎孔、加糖 281 60 1919． 18 表 2 干酪素对产酶活力的影响 干酪素 含量 反应时间( s) 稀释 倍数 酶活力( IU/ml) 1% 483 40 397． 94 2% 563 60 428． 78 3% 463 60 654． 06 4% 502 60 549． 15 5% 469 60 636． 08 2． 分别向浸泡后的大豆中添加 1% ～ 5% 的麦芽糖、 蔗糖、葡萄糖补充大豆中碳源 3． 添加 1% ～ 5% 黄豆粉以期待提高产酶量 4． 在安全剂量内添加硒、铬、碘三种微量元素观察微 量元素对纳豆菌产酶的影响 单因素实验筛选出纳豆菌固态发酵的最佳条件 2 实验结果与分析 2． 1 纳豆菌的筛选 从本实验室培养的纳豆菌株中，分离纯化出 12 株纳 豆菌。

通过纤维蛋白凝块溶解时间法对这 12 株菌进行 纳豆激酶的活力测定，其酶活力由图 3 所示 图 1 不同菌株产酶活力的比较 图 2 碳源对产酶活力的影响由图 3 可看出，NK － 2 菌株产酶活力最高用该菌 进行以下实验 2． 2 固态发酵条件的优化 2． 2． 1 扎孔、加糖对产酶活力的影响 从表 1 可以看出: ⑴在浸泡过的大豆上扎孔后进行发酵，纳豆菌产酶 活力有明显增加这是由于以大豆为发酵培养基的固态 发酵过程，因大豆颗粒较大，与菌液接触不很充分造成 的，这也是固态发酵纳豆激酶活力低于液态发酵的原因 之一通过扎孔的方法可以增加菌体与营养成分的接触 面积，从而产酶活力大大提高 ⑵分装后在大豆表面洒上 2% 的麦芽糖进行发酵，纳 豆菌产酶活力也有明显的增加其原因是: 大豆中蛋白 质含量约为 38． 5%，而碳水化合物只有 29． 4%，其中还有 少量的纤维性物质不易被纳豆菌利用因此，固态发酵 可能因碳源不足，造成酶活较低为避免这一情况，在固 态发酵时添加 2%的麦芽糖来补充碳源，从而产酶活力得 以提高 ⑶将扎孔、加糖两因素同时应用于固态发酵中，结果 产酶活力较单因素更高 2． 2． 2 氮源的优化 发酵基础培养基的氮源因素分别为: 酵母膏、胰蛋白 胨、干酪素和黄豆汁，发酵培养后，测定纳豆菌产酶活力。

以氮源含量为横坐标、纳豆菌产酶活力为纵坐标，选择最 ·52·第 6 期 郑丰杰，等: 纳豆菌固态产酶条件的优化 佳氮源及其浓度 由图 3 可以看出: 表 3 胰蛋白胨对产酶活力的影响 胰蛋白胨 含量 反应时间( s) 稀释 倍数 酶活力( IU/ml) 1% 1113 20 32． 72 2% 865 20 56． 40 3% 871 20 55． 63 4% 925 20 48． 84 5% 926 20 48． 71 表 4 酵母膏对产酶活力的影响 酵母膏 含量反应时间( s) 稀释 倍数 酶活力( IU/ml) 1% 578 150 1013． 02 2% 404 170 2515． 77 3% 519 210 1789． 23 4% 484 200 1980． 73 5% 723 210 887． 86 图 3 氮源对产酶活力的影响 ⑴干酪素作为氮源时，其添加量为 3% 时纳豆激酶活 力最高但总体上对纳豆菌产酶的影响不大，这可能是 由于干酪素作为氮源不利于纳豆菌的吸收利用 ⑵以胰蛋白胨为氮源时，纳豆菌产酶活力很低，添加 量 2%时达到最高点，酶活力也只有 56． 40 IU/ml。

因此， 胰蛋白胨不利于纳豆菌的吸收利用，不能提供其生长所 需的氮源 ⑶酵母膏作为纳豆菌生长的氮源时，产酶活力较高 浓度较低时，菌体由于养分不足导致生长缓慢，产酶活力 也较低，随着添加量增加为 2% 时酶活力也达到最大值， 这就是纳豆菌产酶的最适氮源含量3% 时有略微下降， 4% 又上升，5% 急剧下降，这是由于稀释倍数不同而导致 的: 因为尿激酶标准曲线中，随时间的增加酶活呈现对数 下降趋势，这样稀释倍数的线性增加远远比不上酶活的 对数下降，从而导致所测酶活的下降酵母膏含量 3% 和 5% 时稀释倍数为 210 倍，而 4% 时的稀释倍数为 200 倍， 稀释倍数大的测得的酶活却低 综合考虑稀释倍数与所测酶活，2% 和 4% 处的酶活 相近，为得到最佳浓度，经再次实验得出 2% 为最佳氮源 浓度 结果分析: 由表 5 可以看出，纳豆激酶活力在黄豆汁 含量为 4%、6%呈上升趋势，在 8% 时达到最高这时黄 豆汁的添加量是纳豆菌生长的最适氮源含量10% ～ 14% 酶活呈现小幅下降趋势 表 5 黄豆汁对产酶活力的影响 含量 反应时间( s) 稀释 倍数 酶活力( IU/ml)4% 413 50 696． 01 6% 397 70 1062． 71 8% 344 70 1453． 31 10% 354 70 1392． 75 12% 372 70 1224． 33 14% 377 70 1196． 18 表 6 黄豆粉对产酶活力的影响 黄豆粉 含量( %) 反应时间( s) 稀释 倍数 酶活力( IU/ml) 空白 412 60 841． 76 1% 443 80 963． 93 2% 396 80 1225． 98 3% 371 80 1411． 16 4% 365 80 1457． 22 5% 480 80 805． 32。