盐胁迫对植物体内游离脯氨酸积累的影响.doc

一、实验课题名称：盐胁迫对植物体内游离脯氨酸积累的影响 二、文献综述： 【1】作物生长的环境并不总是合适的干旱、炎热、霜冻、盐碱、涝灾，以及环境污染、病虫害等都会对作物的生长导致不利的影响作物的抗逆性是整体性的也许存在着共同的机制以抵御整个生育期的多种逆境胁迫，现综述如下  l．渗入调节  己有大量研究表白，渗入调节是抗旱性的一种重要机制水分亏缺条件下，叶片和根系渗入调节的生理效应重要是如下两个方面：一是增长吸取，保持膨压，缓和脱水胁迫，改善细胞水分状况；二是改善水分胁迫植物的生理功能，维持一定的生长和光合能力，提高植物在低水势下的生存能力  Jordan（1984）试图从植株整体系统上量化渗入调节的作用，她们用模型模拟得出如下结论，渗入调节的作用并不能找出影响产量的复杂因素，在干旱条件下由于缺少渗入调节能力，小麦虽然有大量的根系仍不能正常生长（Mcgown，l984）李德全等（1994）在盆栽实验条件下研究表白，抗旱性强的品种渗入调节能力均不小于抗旱性弱的品种李秀菊（1992）在大田实验条件下，测定了3个抗寒性不同冬小麦品种越冬期抗寒力变化与渗入调节的关系成果表白，抗寒锻炼期间冬小麦抗寒能力逐渐提高，抗寒性越强的品种增强的幅度愈大。

随着抗寒力的增强，渗入势减少，抗寒力愈强的品种下降幅度愈大与渗入变化有关的可溶性糖等渗入物和水分状况均向减少渗入势的方向发展 2．脯氨酸有研究表白，一般萎蔫较快的作物脯氨酸积累也较快Aspinall和Paleg(1987）讨论了胁迫条件下脯氨酸积累作为一种抗旱因素的也许性，得出结论如下，脯氨酸是一种细胞亲和溶质，积累数它可影响渗入调节换句话说，对液泡中重要渗入物质钾的积累来讲，脯氨酸起细胞质渗入调节平衡作用Barderska（1993）觉得，脯氨酸也许在避免酶蛋白脱水和渗入胁迫方面起一定的作用，因而把它看做对植物有利的反映，有人还提出把它作为作物抗旱育种的指标，但是后来倾向觉得，这是植物受到胁迫损害的一种症兆，并且Bawa和Sen（1993）指出，有些能较好适应水分胁迫的植物并不总是积累大量的脯氨酸 有研究表白，脯氨酸可作为脱水胁迫、高温胁迫时多种酶的保护剂，脯氨酸很也许起保护膜不受高温破坏的作用已发现花粉中富含游离的脯氨酸花粉从基质中大量摄取脯氨酸，而脯氨酸含量的增长可以改善其热胁迫下的活力近年来的大量研究表白，脯氨酸和甘氨酞甜菜碱能起到细胞的热保护剂作用。

缺水能引起这些代谢产物积累，热胁迫对它们积累与否有明显作用还不拟定Chu等(1974）的研究表白，只有在缺水的条件下，高温才导致大麦积累脯氨酸，在组织水势不减少的条件下，热胁迫不能引起脯氨酸积累，不管脯氨酸与否能因热胁迫而积累，而它却在受旱胁迫时大量积累，这就波及到大田环境中的热胁迫，由于干旱和炎热往往同步发生脯氨酸是在盐胁迫条件下易积累的一种氨基酸，也是盐生植物的一种非常重要的调节渗入压物质大麦叶片积累脯氨酸含量与外界环境中Na+的浓度成线性关系，有些植物脯氨酸是Na+胁迫的专一性反映如在NaCl介质中生长的鹰嘴豆耐NaCl品种，其体内积累的脯氨酸含量比敏感品种要高而在KCI的介质中，其体内脯氨酸的含量下降 .张正斌等，《作物杂志》1997年第4期【2】游离脯氨酸的积累是植物对水分胁迫的一种普遍反映，无论是土壤干旱还是盐溶液引起的水分胁迫，都会使植物体内游离脯氨酸含量明显增高在渗入胁迫条件下，小麦胚芽鞘中游离脯氨酸在抗旱性强的品种中积累较少，在抗旱性弱的品种中积累多土壤干旱使脯氨酸增长的因素也许与蛋白酶活性、蛋白质的合成以及脯氨酸脱氢酶活性受到影响有关土壤干旱也往往引起小麦叶片总的可溶性蛋白质含量下降，但在本实验条件下发现可溶性蛋白质含量下降限度与品种抗旱性强弱没有体现出一致的趋势，这也许是由于实验材料受到渗入胁迫的时间不够。

渗入胁迫也引起SOD超氧化物酶和CAT过氧化物酶活性不同限度下降，但对于上述生理生化变化与否可作为植物抗旱性的指标目前仍有争议.本研究发现，在萌发期小麦渗入(0.975 Mpa)胁迫下，胚芽鞘脯氨酸以及其他生理生化指标相对含量与目前已广泛应用的抗旱指标(抗旱指数和抗旱系数)进行了有关性分析，成果表白部分指标与抗旱指数存在明显有关性，如胚芽鞘脯氨酸含量、CAT活性、SOD活性等，因此这些指标可以用来对小麦的抗旱性进行初步鉴定 张玉梅，林琪，姜雯，张延胜，李忠 渗入胁迫条件下不同抗旱性小麦品种萌发期生理生化指标的变化 [期刊论文] 麦类作物学,26(6)：125～130【3】自1954年发现了黑麦牧草在水分胁迫下叶片累积脯氨酸现象以来，诸多研究表白，逆境条件下脯氨酸大量累积可以增强抗逆性，并且阐明了脯氨酸累积的途径和也许的生理作用如在植物细胞适应胁迫过程中作为渗入调节物质、氮素储藏物质、避免大分子化合物变性、减少由胁迫引起的细胞内酸度、作为呼吸作用的底物、维持膜稳定性和保护植物免受自由基伤害等植物体内脯氨酸合成重要通过两条途径：谷氨酸途径和鸟氨酸途径，两条代谢途径中的核心酶分别是吡咯啉一5一羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸转氨酶(OAT)。

脯氨酸降解中的核心酶是脯氨酸脱氢酶(PDH)其中，PDH和OAT定位粒体上，P5CS重要存在于细胞质基质中有关游离脯氨酸累积与植物抗性关系的研究成果也不尽一致，一部分报道觉得脯氨酸累积是积极积极的适应性反映，与抗性有关此外一种观点觉得脯氨酸累积是胁迫反映，与抗性无关本实验研究表白，脯氨酸累积既有积极一面，又有悲观一面结合不同浓度硝酸钾解决以及有关胁迫指标来看，PEG胁迫下2 mmol/L的硝酸钾增进脯氨酸累积是积极的适应性反映，由于此时的丙二醛含量和细胞膜相对透性明显低于单纯PEG胁迫但是相对较高浓度的硝酸钾解决，10 mmol·L-1的硝酸钾明显增长脯氨酸含量，这种增长也许是悲观的，表目前丙二醛含量和细胞膜相对透性都不小于单纯PEG胁迫解决，阐明这个浓度下脯氨酸的累积属于胁迫反映结合脯氨酸代谢途径中的核心酶活性变化规律，可以看出高浓度硝酸钾解决明显克制了脯氨酸脱氢酶PDH活性，导致了游离脯氨酸大量累积曹芳，魏永胜 渗入胁迫下硝酸钾对烟草脯氨酸代谢途径的影响 [期刊论文]--《西北农业学报》 ，19(9)：144—148三、实验目的与规定：1、学习脯氨酸含量测定措施； 2、研究盐胁迫等逆境对植物体内脯氨酸含量的影响。

四、实验条件：1、实验试剂：3%磺基水杨酸，甲苯，冰醋酸，酸性茚三酮试剂（25g茚三酮溶于60ml冰醋酸和40ml 6mol/L磷酸中,加热（70℃）溶解常温保存期24h，冰箱中保存48h），原则脯氨酸溶液（10mg脯氨酸溶于100ml80％乙醇中，浓度为100ug/ml）；2、实验仪器：天平，研钵，移液管，水浴锅，离心机，试管，722型分光光度计；3、实验材料： 小麦、水稻五、实验原理与措施： 胁迫条件下植物体内脯氨酸大量积累，并且胁迫时间越长,积累的脯氨酸越多；因此植物体内的脯氨酸含量在一定限度上反映了植物受胁迫影响的限度，可作为植物对逆境响应的一种参照指标 在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反映，生成红色化合物，此产物在520nm波长下具有最大吸取峰，可用分光光度计测定，此法具有专一性在pH1-7时用人造沸石可以除去某些干扰的氨基酸六、实验环节：1、准备实验材料 提前一周培养小麦、水稻，并根据实验目的对其分组解决，以备后用小麦种子黑暗中25℃下用蒸馏水浸泡6h,使其充足吸涨，播于铺有湿滤纸的培养皿中于暗室中培养露白后与尼龙网架上用水培养24h将小麦、水稻各分为3组，分别用0.2、0.4、0.6mol∕L的NaCl溶液培养3~4天，取地上部分做实验材料。

2、制作原则曲线100ug/ml脯氨酸配备成0、1、2、3、4、5μg/ml一系列浓度的原则溶液取原则溶液各2ml，加入2ml3%磺基水杨酸、１ml冰醋酸和3ml茚三酮试剂于加塞试管中，充足混匀后在沸水浴中加热显色40min，冷却后加入４ml甲苯盖好盖子充足震荡，待其静置分层后，吸取红色甲苯相，于波长520nm测定OD值，以OD值为纵坐标，脯氨酸浓度（ μg/ml ）为横坐标绘制原则曲线3、NaCl胁迫对小麦脯氨酸含量的影响分别取对照和NaCl解决的小麦幼苗的地上部分（芽鞘和叶子）0.3g，用3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10分钟，加入0.5g人造沸石充足震荡，冷却后转移至离心管中，3000r/min离心10min，取上清液待测各取对照和NaCl解决的提取上清液2ml，分别加入2ml蒸馏水，１ml冰醋酸和3ml2.5 %酸性茚三酮试剂，与上述制作原则曲线同样进行显色，萃取和比色，最后从原则曲线中查得脯氨酸含量按照公式计算,植物体内脯氨酸含量（ug/g）=4A×2.5/0.3,其中Ａ为查表所得的脯氨酸七、实验数据的解决：通过对标液的测定得：脯氨酸浓度0246810OD值00.1580.1620.2280.2430.461由之得原则回归曲线：脯氨酸原则曲线为：y=0.0375x+0.0211；测得实验组和对照组小麦、水稻幼苗地上部分的吸光值分别为： 　0.20.40.6小麦0.3750.8330.843水稻0.1550.1940.39因此：小麦：实验组1：当y=0.375时，A=x=9.44ug/ml 实验组2：当y=0.833.时，A=x=21.65ug/ml 实验组3：当y= 0.843时，A=x=21.91ug/ml水稻：实验组1：当y=0.155时，A=x=3.57ug/ml 实验组2：当y=0.194时，A=x=4.61ug/ml 实验组3：当y=0.390时，A=x=9.83ug/ml八、实验成果与分析不同盐浓度下，脯氨酸积累量不同，浓度越高其脯氨酸积累量越高。

小麦较水稻而言其脯氨酸含量随盐浓度变化变化更大，阐明小麦比水稻受盐胁迫的影响限度更大，此植物对盐的抗逆性较差在解决实验组前也可明显发现小麦萎蔫限度较水稻更明显九、实验小结：1、配备的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最佳现用现配；2、在提取过程中提取、反映要充足；3、离心前必须平衡，外管壁要干燥，离心机要水平放置等待离心机完全停止后再取出试管；4、甲苯有毒，需格外小心，注意教室通风；5、使用分光光度计时，先调好波长，使用比色皿时只能拿粗糙面，使用前必须润洗。