基因工程制胰岛素生工版课件.ppt

用基因工程方法用基因工程方法获得胰得胰岛素素第四组1基因工程制胰岛素生工版胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子具有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗2基因工程制胰岛素生工版基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法化学合成A链和B链的编码序列3基因工程制胰岛素生工版基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法表达产物的后期处理路线：4基因工程制胰岛素生工版基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法基因工程菌的构建战略：5基因工程制胰岛素生工版基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法表达产物的后期处理路线：6基因工程制胰岛素生工版基因工程制胰岛素三种方法三、A链和B链同时表达法7基因工程制胰岛素生工版方法一：    由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%￿-￿20%，因此成本高。

方法二：    胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率提高，折叠率高工艺路线依然繁琐方法三：    需体外折叠基因工程制胰岛素三种方法三种方法比较：8基因工程制胰岛素生工版基因工程基因工程获取胰取胰岛素的步素的步骤一、获取外源目的基因片段二、选择与获取表达载体三、重组目的DNA片段与表达载体四、选择与获取表达细胞五、重组体导入表达细胞六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定七、工程菌产物鉴定和保存八、发酵培养9基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段1．选择实验材料2．提取RNA，分离RNA3．逆转录mRNA,得cDNA第一链4．得双链DNA5．DNA序列纠错6. 目的基因通过细胞克隆扩增7. 目的基因回收及DNA测序，最终目的基因获取10基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段1．选择实验材料胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛素是胰岛B细胞（即胰岛β细胞）受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的胰岛素基因只有在胰岛B细胞中才能转录出信使RNA，所以用基因工程方法生产胰岛素时，选用胰岛B细胞为获取目的基因的实验材料11基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段2．提取RNA，分离RNA         2．1￿总RNA的提取￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿2．2￿mRNA的纯化￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿2．3￿mRNA的保存12基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段2．1￿总RNA的提取￿￿￿￿总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。

苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性提取RNA时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入TRIzol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA的纯化 13基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段2．1．1 TRIzol法提取流程（1）样品处理①￿培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，混匀，室温静置5min②￿组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol充分匀浆，室温静置5min2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min3）4℃离心，12000g*15min，取上清液4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5）4℃离心，12000g*10min，弃上清液6）加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀4℃，7500g*5min，弃上清液7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）14基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段2．1．1 TRIzol法提取流程图15基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段2．2￿mRNA的纯化该方法利用mRNA 3＇端含有PolyA（多聚腺苷酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的mRNA16基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段2．．2．．1 寡聚（寡聚（dT））纤维素柱素柱纯化化mRNA（（1））试剂准准备：：①￿①￿3M醋酸醋酸钠（（pH5.2）；）；②￿②￿0.1M NaOH；；③￿③￿上上样缓冲液：冲液：20mM Tris-HCl（（pH7.6））,0.5M NaCl,1M EDTA (pH8.0),0.1%SLS(十二十二烷基氨酸基氨酸钠)配制时可先配制可先配制Tris-HCl（（pH7.6）、）、NaCl、、EDTA（（pH8.0）的母液，）的母液，经高高压消毒后按各成分确切含量，消毒后按各成分确切含量，经混合后再高混合后再高压消毒，冷却至消毒，冷却至65℃℃，加入，加入经65℃℃温育（温育（30min）的）的10%SLS至至终浓度度为0.1%；；④￿④￿洗脱洗脱缓冲液：冲液：10mM Tris-HCl（（pH7.6），），1mM EDTA（（pH8.0），），0.05%SDS；；⑤￿⑤￿无水乙醇、无水乙醇、70%乙醇；乙醇；⑥￿⑥￿DEPC（（0.1%焦炭酸二乙焦炭酸二乙酯））￿ ￿17基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA（（2）操作步）操作步骤：：①￿①￿将将0.5-1.0g寡聚（寡聚（dT））纤维悬浮于浮于0.1M的的NaOH溶液中。

溶液中②￿②￿用用DEPC处理的理的1ml 注射器或适当的注射器或适当的细管，将寡聚（管，将寡聚（dT））纤维素装柱素装柱0.5-1ml，用，用3倍柱床体倍柱床体积的的DEPCH2O洗柱③￿③￿使用使用1*上上样缓冲液洗柱，直至洗出液冲液洗柱，直至洗出液pH值小于小于8.0④￿④￿将将RNA溶解于溶解于DEPCH2O中，在中，在65℃℃中温育中温育10min左右，冷却至室温后加入等体左右，冷却至室温后加入等体2*上上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液当冲液，混匀后上柱，立即收集流出液当RNA上上样液全部液全部进入柱床后，再用入柱床后，再用1*上上样缓冲液洗柱，冲液洗柱，继续收集流出液收集流出液⑤￿⑤￿将所有流出液于将所有流出液于65℃℃加加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液冷却至室温后再次上柱，收集流出液⑥￿⑥￿用用5-10倍柱床体倍柱床体积的的1*上上样缓冲液洗柱，每管冲液洗柱，每管1ml分步收集，分步收集，OD260测定定RNA含量前部分收集管中流出液的前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物很高，其内含物为无无polyA尾的尾的RNA后部分收集后部分收集管中流出液的管中流出液的OD260值很低或无吸收。

很低或无吸收⑦￿⑦￿用用2-3倍柱容倍柱容积的洗脱的洗脱缓冲液洗脱冲液洗脱poly（（A+））RNA，分步收集，每部分，分步收集，每部分为1/3-1/2柱柱体体积⑧￿⑧￿OD260测定定poly（（A+））RNA分布，合并含分布，合并含poly（（A+））RNA的收集管，加入的收集管，加入1/10体体积3M NaAc（（pH5.2）、）、2.5倍体倍体积的的预冷无水乙醇，混匀，冷无水乙醇，混匀，-20℃℃放置放置30min⑨￿⑨￿4℃℃离心，离心，10000g*15min，小心吸弃上清用，小心吸弃上清用70%乙醇洗乙醇洗涤沉淀4℃℃离心，离心，10000g*5min，弃上清，室温晾干弃上清，室温晾干⑩￿⑩￿用适量的用适量的DEPCH2O溶解溶解RNA18基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA（（3）注意事）注意事项①￿①￿整个整个实验过程必程必须防止防止Rnase的的污染②￿②￿步步骤④④中将中将RNA溶液置溶液置65℃℃中温育然后冷却至室温再上中温育然后冷却至室温再上样的目的有的目的有两个，一个是破坏两个，一个是破坏RNA的二的二级结构，尤其是构，尤其是mRNA poly（（A+）尾）尾处的二的二级结构，使构，使poly（（A+）尾充分暴露，从而提高）尾充分暴露，从而提高poly（（A+））RNA的回收率；另一个目的是能解离的回收率；另一个目的是能解离mRNA与与rRNA的的结合，否合，否则会会导致致rRNA的的污染。

所以此步染所以此步骤不能省略不能省略③￿③￿十二十二烷基肌氨酸基肌氨酸钠盐在在18℃℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，，若室温低于若室温低于18℃℃最好用最好用LiCl替代替代NaCl④￿④￿寡聚（寡聚（dT））纤维素柱可在素柱可在4℃℃贮存，反复使用每次使用前存，反复使用每次使用前应该依依次用次用NaOH、、灭菌菌ddH2O、上、上样缓冲液洗柱冲液洗柱⑤￿⑤￿一般而言，一般而言，107哺乳哺乳动物培养物培养细胞能提取胞能提取1-5μg poly（（A+））RNA，，约相当于上柱相当于上柱总RNA量的量的1%-2%19基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段2．3￿mRNA的保存用少量水溶解mRNA，即可用于cDNA合成或保存在70%乙醇中并于-70℃下贮存20基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段胰胰岛素基因素基因mRNA序序列列21基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段胰胰岛素基因素基因mRNA序序列列NCBI中搜索得22基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段3．逆转录mRNA,得cDNA第一链￿mRNA在反在反转录酶的作用下由引物引的作用下由引物引导合成合成cDNA。

加入高加入高浓度的度的 Oligo（（dT）引物，）引物， ，，Oligo（（dT）引）引物与物与 mRNA 的的 3' 末端的末端的 poly（（A）配）配对，引，引导反反转录酶以以 mRNA 为模板合成第一模板合成第一链 cDNA 这种种 cDNA 合成的方法在合成的方法在 cDNA 文文库构建中构建中应用极用极为普遍，其缺点主要是由于普遍，其缺点主要是由于 cDNA 末端存在末端存在较长的的 poly（（A）而影响）而影响 cDNA 测序原因：序原因：oligo （（￿ ￿dT ））结合在合在￿ ￿mRNA 的的￿ ￿3‘ 端，因此合成全端，因此合成全长的的￿ ￿cDNA 需要反需要反转录酶从从￿ ￿mRNA 分子的一端移分子的一端移动到另到另一端，有一端，有时这种全合成种全合成难以达到）以达到）23基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段4．得双链DNA         4.1合成cDNA第二链得双链DNA          4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增￿24基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二链得双链DNA mRNA－－cDNA 杂合双合双链中的中的 mRNA 链在在 RNA 酶 H 作用下先形成很多作用下先形成很多切口，切口， mRNA 链就被切割成很多的小片段，就被切割成很多的小片段，这些小片段些小片段为大大肠杆菌杆菌 DNA 聚合聚合酶 ⅠⅠ 提供了合成第二提供了合成第二链的引物。

大的引物大肠杆菌杆菌 DNA 聚合聚合酶 ⅠⅠ 以以第一第一链 cDNA 为模板合成一段段互模板合成一段段互补的的 cDNA 片段这些些 cDNA 片段片段进而在而在 DNA 连接接酶的作用下的作用下连接成一条接成一条链，即，即 cDNA 的第二的第二链遗留在留在 5'-末端的一段很小的末端的一段很小的 mRNA 也被大也被大肠杆菌杆菌 DNA 聚合聚合酶 ⅠⅠ 的的 5'3' 核核酸外切酸外切酶和和 RNA 酶 H 降解，暴露出与第一降解，暴露出与第一链 cDNA 对应的的 3'-端部分序端部分序列同时，大，大肠杆菌杆菌 DNA 聚合聚合酶 ⅠⅠ 的的 3'--5' 核酸外切核酸外切酶的活性可将暴露的活性可将暴露出的第一出的第一链 cDNA 的的 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端端部分消化掉，形成平端或差不多的平端优点点:   a)合成合成cDNA的效率高的效率高￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿b)直接利用第一直接利用第一链的反的反应产物物,不需不需纯化化￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿c)避免使用避免使用S1核酸核酸酶来切割双来切割双链cDNA25基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二链得双链DNA 26基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增￿4.2.1模板模板DNA的的变性性向离心管加入ＤＮＡ模板、引物、耐向离心管加入ＤＮＡ模板、引物、耐热的的DNA聚合聚合酶、、PCR缓冲液（冲液（￿ ￿500mm01／／L KCl；；100mmol／／L Tris一一HCl(pH8.4)，，150mmol／／L MgCl2，，lmg／／m1明胶）、明胶）、5mmo1／／L dNTP贮备液，然后加液，然后加热至至93℃℃左右一定左右一定时间后，使模板后，使模板DNA双双链或或经PCR扩增形成的双增形成的双链DNA解离，使之成解离，使之成为单链，，以便它与引物以便它与引物结合，合，为下下轮反反应作准作准备27基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增￿4.2.2模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)模板模板DNA经加加热变性成性成单链后，温度降至后，温度降至55℃℃左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互的互补序列序列配配对结合合；；28基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增￿4.2.3引物的延伸引物的延伸DNA模板模板--引物引物结合合￿ ￿物在物在TaqDNA聚合聚合酶的的作用下，以作用下，以dNTP为反反应原料，靶序列原料，靶序列为模板，模板，按碱基配按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新与半保留复制原理，合成一条新的与模板的与模板DNA 链互互补的半保留复制的半保留复制链，重复，重复循循环变性性--退火退火--延伸三延伸三过程，就可程，就可获得更多得更多的的“半保留复制半保留复制链”，而且，而且这种新种新链又可成又可成为下次循下次循环的模板。

每完成一个循的模板每完成一个循环需需￿ ￿2～～4分分钟，，2～～3小小时就能将待就能将待扩目的基因目的基因扩增放增放大几百万倍大几百万倍29基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段5.目的基因回收纯化及DNA测序纠错￿￿￿￿￿￿￿￿￿5.1 将目的基因进行回收纯化￿￿￿￿￿￿5.2 对目的基因进行测序￿￿￿￿￿￿5.3 DNA序列纠错30基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段 5.1 将目的基因进行回收纯化1) 在在PCR试管中加入凝胶管中加入凝胶缓冲液冲液进行行琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳电泳到泳到适当位置后在目的适当位置后在目的DNA条条带的前端挖一的前端挖一长方形槽，向槽方形槽，向槽中加入融化的低熔点胶，待凝固后中加入融化的低熔点胶，待凝固后进行行电泳2）当）当DNA进入低熔点胶中心入低熔点胶中心时停止停止电泳紫外灯下切下目的泳紫外灯下切下目的条条带的低熔点胶的低熔点胶￿ ￿3) 将切下的胶放到离心管中，加入将切下的胶放到离心管中，加入200μｌ的ＴＥｌ的ＴＥ缓冲液，冲液，65℃℃温浴温浴3分分钟以融化低熔点胶以融化低熔点胶4) 然后分然后分别用酚用酚/氯仿，仿，氯仿抽提一次。

取上清，加入仿抽提一次取上清，加入2倍体倍体积的无水乙醇，的无水乙醇，-20℃℃沉淀沉淀DNA 2h以上，以上，12 000rpm离心离心15min，弃上清，用，弃上清，用70%乙醇洗乙醇洗涤，吹干后溶于，吹干后溶于10μl无菌无菌水中注意事注意事项：在紫外灯下切出含有目的：在紫外灯下切出含有目的DNA 片段的片段的琼脂糖凝胶脂糖凝胶时应注意要快速操作，以免注意要快速操作，以免损伤ＤＮＡ31基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段 5.2 对目的基因进行测序利用利用DNA聚合聚合酶，以待，以待测单链DNA为模板，以模板，以dNTP为底物，底物，设立四种相互独立的立四种相互独立的测序反序反应体系，在每个体系，在每个反反应体系中加入不同的体系中加入不同的ddNTP作作为链延伸延伸终止止剂在测序引物引序引物引导下，按照碱基配下，按照碱基配对原原则，每个反，每个反应体系体系中合成一系列中合成一系列长短不一的引物延伸短不一的引物延伸链，通，通过高分辨率高分辨率的的变性聚丙性聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳分离，放射自泳分离，放射自显影影检测后，后，从凝胶底部到从凝胶底部到顶部按部按5’至至3’方向方向读出新合成出新合成链序列，序列，由此推知待由此推知待测模板模板链的序列。

的序列32基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段 5.2 对目的基因进行测序33基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段 5.3 DNA序列纠错1、将待突、将待突变基因克隆到突基因克隆到突变载体上；体上；2、制、制备含突含突变基因的基因的单链模板；模板；3、人工合成一段改、人工合成一段改变了碱基了碱基顺序的寡核苷酸片段，序的寡核苷酸片段，以此作以此作为引物，在体外合成互引物，在体外合成互补链，，获得含有得含有错配碱配碱基的完整双基的完整双链M13DNA4、、转化和初步化和初步筛选异源双异源双链DNA分子分子转化大化大肠杆菌杆菌后，后，产生野生型、突生野生型、突变型的同源双型的同源双链DNA分子5、用、用诱变的寡核苷酸引物作的寡核苷酸引物作为探探针，通，通过杂交即可交即可鉴定出突定出突变体体￿ ￿34基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段6、目的基因通过细胞克隆扩增6.1￿目的基因与运载体结合6.2￿将目的基因导入受体细胞并使之扩增6.3￿筛选获得了重组DNA分子的受体细胞克隆35基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段6.1￿目的基因与运载体结合用用与与提提取取目目的的基基因因相相同同的的限限制制酶切切割割质粒粒使使之之出出现一一个个切切口口；；将将目目的的基基因因插插入入切切口口处，，让目目的的基基因因的的黏黏性性末末端端与与切切口口上上的的黏黏性性末末端端互互补配配对；；在在连接接酶的的作作用用下下连接形成重接形成重组DNA分子。

分子36基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段6.2￿将目的基因导入受体细胞并使之扩增要要让目的基因表达，必目的基因表达，必须将它将它导入受体入受体细胞并胞并进行行扩增为获得目的基因的表达得目的基因的表达产物物时，通常以大，通常以大肠杆菌杆菌等无害易得的等无害易得的细菌菌为受体注意：注意：为改改进某种生物某种生物时，将欲改，将欲改进的生物的生物细胞胞为受受体为使重使重组的的DNA分子更容易分子更容易进入受体入受体细胞，通常胞，通常还要用一些物要用一些物质对受体受体细胞胞进行行处理，使受体理，使受体细胞具胞具有更大的通透性，例如改有更大的通透性，例如改变PH值，加入，加入氯化化钙等37基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段6.3￿筛选获得重组DNA分子的受体细胞克隆前前几几步步的的处理理十十分分繁繁锁，，为保保证目目的的基基因因得得到到有有效效利利用用，，通通常常用用大大量量的的受受体体细胞胞来来接接受受不不多多的的目目的的基基因因这样，，处理理的的受受体体细胞胞中中真真正正摄入入了了目目的的基基因因的的很很少少，，必必须将将它它从从中中检测出出来来细菌菌的的检测，，将将每每个个受受体体细胞胞单独独培培养养形形成成菌菌落落，，检测菌菌落落中中是是否否有有目目的的基基因因的的表表达达产物物。

淘淘汰汰无无表表达达产物物的的菌菌落落，，保保留留有有表表达达产物物的的进一一步步培培养养、、研研究究多多细胞胞生生物物的的检测，，将将每每个个受受体体细胞胞单独独培培养养并并诱导发育育成成完完整整个个体体，，检测这些些个个体体是是否否摄入入目目的的基基因因，，摄入入的的基基因因是是否否表表达达（（是是否否表表现出相出相应的性状）的性状）38基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA测序，最终目的基因获取7.1 内容物内容物释放放将培养物加入将培养物加入试管，加入管，加入EDTA及去及去污剂（ＳＤＳ），（ＳＤＳ），用碱用碱处理理细菌，使菌，使细菌的菌的细胞壁破裂，胞壁破裂，释放出放出细胞内胞内容物（在容物（在强碱碱环境下，宿主菌的境下，宿主菌的线性双性双链DNA片段中片段中的的氢键断裂，双断裂，双链解离解离变性，而性，而质粒粒DNA共价共价闭合合环状的双状的双链并不完全分离）并不完全分离）39基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA测序，最终目的基因获取7.2 加酸、离心加酸、离心然然后后加加入入高高浓度度酸酸性性盐，，PH恢恢复复至至中中性性（（变性性的的染染色色体体DNA与与变性性的的蛋蛋白白质以以及及细胞胞碎碎片片凝凝聚聚成成网网络状状大大分分子子不不溶溶性性沉沉淀淀物物，，而而质粒粒DNA又又恢恢复复天天然然构构型型，，能能溶溶解解在在上上清清液液中中）），，通通过离离心心把把染染色色体体DNA，，蛋蛋白白质-SDS复合物等一起除去。

复合物等一起除去40基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA测序，最终目的基因获取7.3 切割、切割、电泳泳利利用用限限制制性性内内切切酶特特异异的的识别DNA特特异异的的核核苷苷酸酸序序列列，，并并切切割割DNA，，产生生一一定定长度度的的DNA片片段段，，通通过电泳泳对酶切前后切前后产物分析可以物分析可以鉴别目的基因目的基因41基因工程制胰岛素生工版一、获取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA测序，最终目的基因获取7.4 回收回收纯化、化、测序序对目的基因目的基因进行回收行回收纯化，再化，再测序序42基因工程制胰岛素生工版二.表达载体的构建•pET28apET28a（含有T7噬菌体启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、T7噬菌体终止子、乳糖阻遏序列、pBR322复制子ori、fl噬菌体复制子、卡那霉素筛选标记序列等43基因工程制胰岛素生工版二.表达载体的构建44基因工程制胰岛素生工版原因：￿￿1.T7噬菌体启动子、核糖体结合位点等引导目的基因高效转录和翻译￿￿2.乳糖操纵子和乳糖阻遏序列存在的意义主要在于，当目的蛋白对大肠杆菌有毒性的时候，可以通过添加阻遏物，控制目的蛋白以较低水平表达。

￿￿3.His6标签序列、凝血酶切割位点存在的意义主要在于方便利用针对His6的整合层析分离纯化蛋白、然后利用凝血酶去除切割标签蛋白  4.卡那霉素抗性基因编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用二.表达载体的构建45基因工程制胰岛素生工版三.重组目的DNA片段和表达载体•用用T7T7噬菌体噬菌体DNADNA连接接酶将将质粒粒载体体pET28apET28a经EcoRⅠEcoRⅠ和和BamH￿Ⅰ￿Ⅰ酶切的片段与目的基因切的片段与目的基因经EcoRⅠEcoRⅠ和和BamH￿Ⅰ￿Ⅰ酶切的片段切的片段连接起来，构成重接起来，构成重组DNADNA分子•使用双使用双酶切：切：DNA分子重分子重组时为了保了保证目的片段以正确的方目的片段以正确的方向向连接接进入入载体，往往尽可能体，往往尽可能选择两种具有不同黏性末端的两种具有不同黏性末端的酶分分别酶切目的切目的DNA分子和分子和载体，体，这种双种双酶切切虽然使然使载体和体和目的目的DNA都都产生两种不同的黏生两种不同的黏性末端，但是性末端，但是连接接酶会会选择把把相同的黏性末端相同的黏性末端连接起来，从接起来，从而保而保证目的基因只以一个方向目的基因只以一个方向连接入接入载体。

体46基因工程制胰岛素生工版四、选择与获取表达细胞1、选择大肠杆菌2、培养大肠杆菌47基因工程制胰岛素生工版四、选择与获取表达细胞1、选择大肠杆菌原因：1）繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定2）基因克隆及表达系统成熟完善3）全基因组测序完成，共有4405个开放性阅读框架4）被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物48基因工程制胰岛素生工版四、选择与获取表达细胞￿￿￿开放阅读框（ORF）是生物个体的基因组中，可能是蛋白质编码序列的部分基因中的ORF包含并位于开始编码与终止编码之间由于一段DNA或RNA序列有多种不同读取方式，因此可能同时存在许多不同的开放阅读框架开放阅读框包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断49基因工程制胰岛素生工版2、大肠杆菌的培养（1）LB（Luria-Bertain)液体培养基配制精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0%酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%氯化钠1.0%搅拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基）调pH至7.0，如用进口试剂可不必调，￿高压灭菌20min(120℃ 0.1Mpa)￿￿￿￿四、选择与获取表达细胞50基因工程制胰岛素生工版四、选择与获取表达细胞（2）牛肉膏蛋白胨培养基￿组成成分：牛肉膏￿3g,蛋白胨￿10g,Nacl 5g,琼脂￿15～20g,水1000mL,PH7.4～7.6。

具体配置步骤：￿1.称药品￿按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速51基因工程制胰岛素生工版四、选择与获取表达细胞具体配置步骤：￿2.加热溶解￿在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分 ￿3. 调pH 检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围.若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节.pH的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度52基因工程制胰岛素生工版四、选择与获取表达细胞具体配置步骤：￿4.过滤￿液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略5.分装￿按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝。

53基因工程制胰岛素生工版四、选择与获取表达细胞具体配置步骤：￿6.加棉塞￿试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞 7.包扎￿加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好.然后用记号笔注明,培养基名称,组别,日期 54基因工程制胰岛素生工版四、选择与获取表达细胞具体配置步骤：￿8.灭菌￿将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min.如因特殊情况不能及时灭菌,则应故人冰箱内暂存 9.无菌检查￿将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h,无菌生长即可使用,或贮存于冰箱或清洁的橱内,备用 55基因工程制胰岛素生工版四、选择与获取表达细胞大肠杆菌培养：采用划痕接种法用接种环从菌种中沾取少量菌液，划线37摄氏度，恒温培养48到72小时，因为接种时和具体培养条件的不同，其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落。

￿菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致￿56基因工程制胰岛素生工版五、重组DNA导入表达细胞•氯化化钙转化法化法￿￿￿￿￿￿￿￿对数生长期的大肠杆菌经冰浴的氯化钙低渗溶液处理，其细胞膜通透性增加，成为感受态细胞（感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态），加入重组质粒，重组质粒与钙离子形成复合物并粘附于细菌细胞膜表面，经42℃热休克处理，细胞膜通透性增加，重组质粒DNA进入感受态细胞（导入重组体）细菌在不含抗生素的培养基中培养一定时间，使含有重组质粒的细胞复原并表达抗生素抗性基因，涂布于含有抗生素的培养板上，生长得到转化子57基因工程制胰岛素生工版氯化化钙法法转化的原理机制：化的原理机制：在0 ℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，￿Ca2+ 使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态此外，Ca 2+￿能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙五、重组DNA导入表达细胞58基因工程制胰岛素生工版氯化化钙转化法要点：化法要点：1. 氯化钙（二价钙离子）的作用：提高细胞壁（膜）的通透性；2. 热激后迅速转移到冰上：促使质粒DNA转移进入胞内；3. 这种转化方法适用于双链环状DNA（质粒），线型DNA不能采用此法。

在自然界自然发生的转化过程中，进入细菌细胞中的为单链DNA五、重组DNA导入表达细胞59基因工程制胰岛素生工版标准质粒DNA、重组质粒DNA、大肠杆菌JM109、离心机、0.1mol/L CaCl2 、LB培养基、微量移液器、微量离心管、抗生素、20mmol/L MgSO4、微孔滤膜及滤器、培养皿、三角瓶、恒温水浴箱￿、恒温摇床￿、超净工作台￿、玻璃涂布棒、95% 乙醇￿实验材料：材料：五、重组DNA导入表达细胞60基因工程制胰岛素生工版注意事注意事项：：①质粒的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋DNA转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低②试剂的质量所用试剂均需要最高纯度的，并用超纯水新鲜配制，灭菌备用③防止杂菌和杂DNA的污染五、重组DNA导入表达细胞61基因工程制胰岛素生工版二价钙离子对转化效率的影响热激温度对转化效率的影响五、重组DNA导入表达细胞62基因工程制胰岛素生工版感受感受态细胞的制胞的制备：1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中；3、培养物于冰上放置20min；4、￿0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；五、重组DNA导入表达细胞63基因工程制胰岛素生工版5、0～4℃，￿4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；6、￿0～4℃，￿4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；￿￿￿制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。

五、重组DNA导入表达细胞64基因工程制胰岛素生工版六、重组体细胞的筛选纯化鉴定•在重组DNA导入受体细胞的实验中，由于重组率很低，因此需要从这些细胞中筛选出期望重组子，将转化后的细胞涂布于特定的固体培养板，生长出的单菌落或噬菌斑进一步筛选和鉴定65基因工程制胰岛素生工版￿￿￿1、载体体遗传标记法法（抗生素抗性筛选法、营养缺陷型筛选法、噬菌斑筛选法、互补筛选法）￿￿￿2、核酸分子核酸分子杂交法交法￿￿菌落原位杂交：制备与目的基因某一区域同源的探针序列，根据核酸杂交原理，探针序列特异性的杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位检测六、重组体细胞的筛选纯化鉴定66基因工程制胰岛素生工版￿￿￿3、目的基因表达目的基因表达产物物测定法定法￿￿如果重组DNA的目的基因能在宿主细胞中编码蛋白质，且宿主细胞本身不含该蛋白质，那么可以通过检测蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定重组子六、重组体细胞的筛选纯化鉴定67基因工程制胰岛素生工版•用荧光原位标记筛选重组体•1、制备核酸探针，通过数据库查询所需的寡核苷酸探针的资料，用ＤＮＡ合成仪合成，然后用荧光素进行标记•２、将样品进行打碎、离心、清洗等步骤，使微生物细胞与杂质进行分离，同时增大细胞壁的通透性，保证探针算例进入与ＤＮＡ杂交。

•３、配置杂交液，其中杂交液中的甲酰胺的浓度直接影响杂交的特异性，将杂交液与样品之一杂交炉（避光、密封），杂交完成后用洗脱液（ＳＥＴ或ＳＳＣ）将多余的探针除去•４、加少量的苯二胺－甘油溶液覆盖样品，防止荧光淬灭，再封片，用荧光显微镜观察、照相进行分析六、重组体细胞的筛选纯化鉴定68基因工程制胰岛素生工版荧光原位杂交技术•荧光原位杂交是一种非放射性原位杂交方法，将荧光标记的探针与待测序列进行杂交，根据杂交信号的有无及类型达到诊断的目的•原理：基于碱基互补配对的原则，用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针，与载玻片上的组织切片等杂交，与待测核酸的靶序列专一性结合，通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位六、重组体细胞的筛选纯化鉴定69基因工程制胰岛素生工版产物1 1.菌种菌种RRhPIZpQE-40￿E．coli￿M15菌株七、工程菌产物鉴定和保存70基因工程制胰岛素生工版2 2.材料与材料与试剂试剂   DEAE-Sepharose￿FF(琼脂糖快流速阴离子交换剂)为杭州争光树脂有限公司产品,SephadexG-25为Sigma公司产品，Superdex75为GE公司产品,溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、胰蛋白酶和羧肽酶B均为Sigma公司产品,谷胱甘肽[氧化型(GSSG)和还原型(GSH)]为上海博奥生物科技有限公司产品，二硫苏糖醇(DTY)为Organics￿Inc产品,13-巯基乙醇和异丙基-13-D-巯基吡喃半乳糖苷(IPTG)为BB1分装,胰蛋白胨、酵母粉（英国Oxiod公司）,氨苄青霉素（美国Sigma公司）,其余试剂均为国产分析纯产品。

七、工程菌产物鉴定和保存71基因工程制胰岛素生工版培养基：（１）LB培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl 10.0,pH 7.0;（２）发酵培养基(g/L):葡萄糖4,甘油15,酵母粉30,蛋白胨30,Na2HPO4 12,KH2PO4 6,NH4C l1,NaCl 2,MgSO4 0.48,pH 7.0;（３）甘油补料培养基(g/L):甘油300,酵母汁150,MgSO4 10,pH 7.0所有培养基使用前均加入氨苄青霉素至终浓度50mg/L水平恒温摇床（德国Therma公司）；Biostat　B发酵系统（德国Braun公司）；蛋白质电泳凝胶自动成像系统（英国Syngene公司）七、工程菌产物鉴定和保存72基因工程制胰岛素生工版3 3.细菌培养和菌培养和RRhPIRRhPI的表达的表达￿￿￿￿￿采用二级发酵的方式，用正交法优化培养条件，并将优化条件用于发酵罐进行发酵，收获湿菌体RRhPIZpQE-40￿E．coli￿M15的发酵罐培养：将lO￿lId经过活化的RRhPI／pQE-40￿E．coli￿M15转移至100￿ml培养基中进行培养，培养一段时间后，将其转移至含有1.5L培养基的发酵罐中，培养一段时间(转速为300r/min，通气量为1:1.5-1:1.8)，过程中加人一定量新鲜的培养基并用NaOH调节pH，之后加入IPTG并升温诱导RRhPI的表达，转速随即调为400-500r／min，增大通气量至1:1.8-1：2.0，继续培养一段时间后，收集菌体。

七、工程菌产物鉴定和保存73基因工程制胰岛素生工版4 4.包涵体的收集和洗包涵体的收集和洗涤￿￿￿￿￿￿将收集的湿菌体冻存于-2O℃￿，然后悬浮于缓冲液A(50mmol/L￿rifs-HC1，0.5mmol/L￿EDTA，50mmol/L￿NaC1，5％￿甘油，0.1-0.5mmol/LDTY，pH7.9)(5-6ml/g湿菌)中，加入溶菌酶(5mg/g湿菌体)，室温或37℃振荡2h冰浴超声10S×30次，其间每次间隔20S，功率为200W10℃条件下1000g离心5min去除细胞碎片上清液中的包涵体(Inclusion￿body,IB)在4℃条件下27000g离心15min收集，然后用含2mol/L尿素的缓冲液A充分悬浮，室温静置30min后4℃条件下17000g离心15min，收集沉淀沉淀再用含2％脱氧胆酸钠的缓冲液A充分悬浮，4℃条件下17000g离心l5min，收集沉淀最后沉淀用10mmol/L￿rifs-HC1,pH7.3洗涤两次(4℃,17000g离心15min)七、工程菌产物鉴定和保存74基因工程制胰岛素生工版•注意事项：细胞内表达的最大问题就是容易形成不溶性的包涵体,它的形成对表达产物的活性不利。

七、工程菌产物鉴定和保存75基因工程制胰岛素生工版•包涵体(inclusionbody)是细菌表达的蛋白质在胞内互相凝集而形成的无活性固体颗粒具有很强的折光性正常的大肠杆菌基因以重组方法使其在大肠杆菌内表达也会形成包涵体说明不仅仅是外源蛋白才能形成包涵体,同时也发现有表达量较低的基因产物也是以不可溶形式存在的包涵体的形成不仅仅与宿主细胞、表达基因有关,还与培养外环境有关系其形成的原因多数认为:目的基因的过度表达使蛋白质无足够时间进行肽链折叠,产生凝集重组蛋白所处的环境条件对包涵体也有较大影响,如当温度超过某一种蛋白质的变性温度时,随着温度的增加凝集量也增加当环境PH接近某一种蛋白的等电点时,蛋白的凝集增加,包涵体的形成也增多,此外,离子组成和强度、辅助因子、氧化还原电位等均可影响包涵体的形成七、工程菌产物鉴定和保存76基因工程制胰岛素生工版•应对方案：      改变发酵条件,如发酵温度、培养的PH值等来减少重组蛋白的凝集,进而有效控制包涵体的形成,给下游纯化工作创造有利条件七、工程菌产物鉴定和保存77基因工程制胰岛素生工版5 5.RRhPIRRhPI的初步的初步纯化化￿￿￿￿将收集的IB用含有0.1％-0.3％13-巯基乙醇的缓冲液B(30mmol/L HC1,8mol/L尿素,pH8.0)溶解,上于已用缓冲液B平衡的DEAE-Sepharose￿FF柱,用合适的氯化钠梯度洗脱,收集含RRhPI的洗脱液。

6 6.RRhPIRRhPI的重的重组复性复性￿￿￿￿将初步纯化后的RRhPI通过Sephadex￿G-25脱尿素,转换缓冲液为不同pH的50mmol/L￿Gly-NaOH重组液,或含有适量GSSG的Gly-NaOH缓冲液中,使蛋白终浓度为0.1-0.6mg/mL，收集趋于正确折叠的RRhPI单体组分,加人适量GSH和GSSG，4℃放置24h七、工程菌产物鉴定和保存78基因工程制胰岛素生工版7 7.酶切切转化化￿￿￿￿￿向RRhPI复性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶B，37℃酶切一段时间,然后用0.1mol/L￿ZnC1终止反应并沉淀生成的hI8 8.hIhI的的纯化化￿￿￿￿￿将hI粗品用30￿mmol/L￿Tris2HCl,8mol/L尿素,pH8.0溶解,在Superdex75上进行分离纯化七、工程菌产物鉴定和保存79基因工程制胰岛素生工版分离分离纯化化￿￿￿￿￿层析柱的平衡液和洗脱液均为0.2￿mol/L￿乙酸钠二乙酸,pH4.0用0.1mol/L￿ZnCl2沉淀的hI粗产品可通过Superdex75进行纯层析图谱见图1,hI主要集中在峰3收集峰3进行SDS2PAGE分析,结果显示,见图2,所得hI组份在SDS2PAGE￿分析中是均一的,只有一条蛋白带。

将峰3组分透析,浓缩并冻干,即可最终制得hI 图图1 1：：Superdex 75 Superdex 75 纯化纯化hIhI 图图2 2　十二烷基磺酸钠　十二烷基磺酸钠- -聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS(SDS- -PAGE)PAGE)七、工程菌产物鉴定和保存80基因工程制胰岛素生工版产物进一步鉴定：（1）氨基酸组成测定取纯化的胰岛素, 经￿5. 7mol /L 盐酸水解, 用氨基酸自动分析仪测定氨基酸组成2）与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合（3）胰岛素的生物活力测定　体内活力用半定量小白鼠惊厥方法测定七、工程菌产物鉴定和保存81基因工程制胰岛素生工版常见的保藏方法有以下几种：（1）短期保存可以用琼脂穿刺进行（2）长期保存大多采取低温保存，用LB培养基培养过夜，离心后加一定的菌种保藏液（含甘油），在-20℃下保藏3）用液氮迅速冷却，减压升华去除水之后在-80℃下保存七、工程菌产物鉴定和保存82基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养发酵培养流程的设计83基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养发酵培养流程的设计84基因工程制胰岛素生工版生产工艺流程功能间分布八、发酵培养85基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养生产工艺流程功能间分布86基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵试验￿•摇瓶培养水平下￿, 用优化的发酵培养基和比浊法测￿RRhPI-pQE40 E.coli M15的生长曲线。

87基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵试验￿•用接种环挑取斜面保存的RRhPI-pQE40E. coli M15一环接种于3ml LB/AK培养基中￿，37℃,220 r·min-1恒温振荡培养一段时间取￿100μl菌液接种于￿5 ml LB/ AK培养基中￿,37℃,220r·min-1恒温振荡培养一段时间即可活化的种子可在4℃下保存数周待用88基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵试验￿•将5ml活化种子转接到50ml优化后的发酵培养基中￿,恒温振荡培养一段时间取50ml经一级发酵扩培后的菌液转接到500ml发酵培养基中￿,恒温振荡培养一段时间后加入￿IPTG诱导人胰岛素原的表达￿,继续恒温振荡培养一段时间后结束发酵3×103r·min-1离心15min,沉淀即得￿RRh2PI-pQE40 E.coli M15湿菌体￿,于-20 ℃保存89基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵试验￿•采用正交法￿,结合摇瓶发酵工艺的前期研究￿,选取摇瓶培养条件中7个主要因素进行两水平正交优化￿,7个因素为种子活化方式、摇床转速￿(通风量) 、IPTG诱导温度、接种量、IPTG添加量、诱导时间和补料方式。

以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的￿A600为目标量考察条件优化的效果90基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵试验￿•进行8次实验￿,对实验结果进行分析￿,优化出最佳实验条件￿,并做￿3 次水平重复试验￿,分别测定每升培养基收获湿菌体的量、发酵液的A600及每升培养基收获包涵体的量IPTG诱导基因工程大肠杆菌表达RRhPI对诱导时间的影响进一步做了分析￿,基因工程菌在三角摇瓶培养至对数生长中期￿,加入￿0.5mmol·L-1IPTG进行诱导￿,每隔1h取样￿,以SDS-PAGE 分析RRhPI的表达情况91基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵结果•在摇瓶培养水平下￿,采用优化的发酵培养基发酵RRhPI-pQE40 E.coli M15 ,培养4h后即进入对数生长期￿,而且对数生长期可延至17h92基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵结果•采用优化出的最佳实验条件做3次平行验证试验结果见表￿93基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵结果•综合每升培养基所收获湿菌体的量(wet weight/g·L-1) 和发酵液的A600两个指标￿,选取关键因素的最优条件￿,结果表明摇床转速￿(即通风量) 与补料方式对发酵结果影响最大￿,IPTG的诱导时间和添加量次之。

￿94基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵结果•正交试验所得菌体经溶菌酶或/声破碎细胞后得到的包涵体SDS-PAGE的结果见图95基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵结果•RRhPI-pQE40 E.coli M15 表达的外源蛋白(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原以包涵体形式存在,其分子大小约为13kD,由图可知,在哪种正交实验条件下包涵体的表达量较高96基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵结果•RRhPI-pQE40 E.coli M15在摇瓶中培养至对数生长中期,加入0.5mmol·L-1IPTG进行诱导,每隔1h取样,以SDS-PAGE分析￿RRhPI的表达情况(如图)97基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•摇瓶发酵结果•结果RRhPI-pQE40 E.coli M15在IPTG诱导4～5h时,富含包涵体的湿菌体(约24kD)收率较高,相应的目的蛋白表达量较高,继续诱导并未使湿菌体表达量有所提高因此,诱导3.5～4h 既有利于富含包涵体的湿菌体及目的蛋白的表达,又可缩短发酵时间,简化生产工艺98基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•细胞的两种破碎方法￿•其一是溶菌酶/超声破碎细胞。

发酵所得￿RRhPI-pQE40 E.coli M15 湿菌体￿,悬浮于适量缓冲液￿A(50mmol·L-1 Tris-HCl、0.5 mmol·L-1EDTA、50 mmol·L-1 NaCl、5% 甘油、0.1～0.5 mmol·L-1 DTT、pH7.90)中￿,加入溶菌酶(5mg·g-1 湿菌体) ,室温或￿37 ℃振荡2h在冰浴中超声(10s×30),每次间隔20s,功率200W99基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•细胞的两种破碎方法￿•其二是超声破碎细胞大肠杆菌湿菌体悬浮于适量的缓冲液A中,充分溶解,冰浴超声￿(40s×10),每次间隔30s,功率200W100基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•细胞的两种破碎方法￿•两种破碎方法所得包涵体洗涤后作SDS-PAGE洗涤时均先后用含2mol·L-1尿素的缓冲液和含2%脱氧胆酸钠(DOC)的缓冲液各洗涤1次,最后用10mmol·L-1Tris-HCl清洗两次101基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•包涵体的三种洗涤方法￿　•溶菌酶/超声破碎细胞的裂解液于4℃、114 ×104r·min-1离心15min,收集沉淀•洗涤方法一是将此沉淀用2mol·L-1尿素的缓冲液充分溶解,离心收集沉淀;沉淀再用￿2%DOC的缓冲液洗涤,离心,所得沉淀用10 mmol·L-1Tris-HCl清洗2次,即得包涵体,于￿-20℃保存。

102基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•包涵体的三种洗涤方法•方法二则用缓冲液充分洗涤沉淀两次,收集沉淀保存•方法三用2%DOC的缓冲液洗涤1次再用10 mmol·L-1Tris-HCl清洗两次,离心收集沉淀保存取上述不同方法洗涤的沉淀￿,用￿SDS-PAGE检测洗涤效果103基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•结果说明“1. 2. 3”项中破碎方法一较好￿,即用溶菌酶和超声破碎结合可彻底破碎细胞,并使表达产物包涵体充分溶出1. 2. 4”项中方法一的洗涤效果优于方法二和三￿,即采用变性剂2mol·L-1尿素及离子型去污剂2%DOC洗涤的效果较好104基因工程制胰岛素生工版菌种活化与菌种活化与扩大培养大培养　￿￿￿￿￿将冻存的工程菌复苏后接种于LB平板培养基,37℃培养24h,挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基,37℃250r/min振荡12h后,按1:100比例转种于LB液体培养基中,继续振荡10h作为发酵种子液八、发酵培养发酵步骤105基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•发酵罐酵罐发酵酵•发酵罐的选取•培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的受体细胞和高表达的基因表达产物。

•发酵罐的组成部分：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统（如 pH、O2、CO2 等）、培养液配制及连续操作装置等￿ ￿发酵步骤106基因工程制胰岛素生工版八、发酵培养•发酵罐酵罐发酵酵发酵步骤107基因工程制胰岛素生工版发酵罐酵罐发酵酵￿ ￿￿￿￿￿￿￿采用自控5L发酵罐进行分批补料发酵试验,初始工作体积为3.0L设置指标为:发酵温度37℃,初始搅拌速度400r/min,初始通气量1.5L/min,不断提高搅拌转速与通气量最大分别至650r/min和3.5L/min以维持溶解氧始终在30%以上,pH￿值诱导前为7.2,诱导后为7.4培养分分批培养和分批补料两个阶段,每隔1h取样测定A650nm、细胞干重和葡萄糖浓度等参数当检测到培养基中葡萄糖耗尽时开始采用pH-stat反馈流加的方式补料,即当发酵液的pH达到7.4时设定pH反馈,高于设定的pH即开始补加发酵补料培养基,直至达到设定的pH时停止流加;补料总量为发酵液总体积的20%诱导后培养5-7h,放罐,SDS-PAGE检测表达情况八、发酵培养发酵步骤108基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵酵补料控制工料控制工艺      以甘油作为限制性基质进行分批补料发酵,分别考察不同补料模式对工程菌生长和重组蛋白表达的影响:      (1)恒速补料法￿￿在开始诱导后,分别依照恒定的速度(10,20,30,40mL/h)流加甘油补料培养基,通过流加氨水和稀盐酸控制pH值。

      (2)分阶段变速补料法￿￿在开始诱导后,以20mL/h的初速度流加甘油补料培养基,并以5mL/h的增加速度,逐渐提高补料速度      (3)恒定pH反馈补料法￿￿在发酵的不同阶段设定培养环境的pH(初始培养期以发酵培养基pH7.0为设定值,诱导期pH根据分批培养结果设定为其最佳值),用甘油补料培养基维持不同时期系统pH的相对恒定八、发酵培养发酵步骤109基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件1.培养基培养基组成：成：（1）碳源　大肠杆菌高密度高表达发酵控制中优化碳源是关键因素常用的碳源有糖类、低碳醇、油脂和有机酸等由于大肠杆菌利用葡萄糖生长速度快, 并且测定方便, 葡萄糖是目前大肠杆菌发酵中最常用的碳源物质￿但葡萄糖添加过量时容易使大肠杆菌生长速率过大,导致葡萄糖效应,产生乙酸等代谢副产物,不仅影响菌体的生长,而且不利于外源蛋白的表达以甘油代替葡萄糖作为碳源可以有效减少抑制性代谢产物乙酸的积累, 更有利于重组菌的高密度发酵八、发酵培养发酵步骤110基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件（2）无机盐　微生物要维持正常的生长代谢, 除需要碳源和氮源外还需要￿Ca2+、Mg2+、K+、Na+等必需离子, 这些离子参与细胞的基础代谢, 调节酶系活性并维持细胞膜内外渗透压平衡。

3）微量元素￿　微生物对￿Fe2+、Mn2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Zn2+微量元素需求量很少, 但微量元素对微生物的生长起很大的作用八、发酵培养发酵步骤111基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件2.诱导剂的的选择：：￿￿￿￿￿￿目前最常用于诱导大肠杆菌表达异源蛋白的诱导剂是异丙基-β-D 硫代半乳糖(ITPG)￿尽管￿IPTG 的诱导效果令人满意, 但是￿IPTG 的缺点限制了它在大规模发酵生产中的应用一方面￿IPTG 价格十分昂贵, 尤其在大批量生产重组蛋白时, IPTG 的大量应用会造成生产成本的增加;另一方面IPTG 对人体具有毒性, 会对发酵所得的生物产品带来不利影响八、发酵培养发酵步骤112基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件采用乳糖作为诱导剂￿￿￿￿￿￿      目的产物占总蛋白量的￿15.7 %, 略低于IPTG的诱导效果, 但成本仅为用IPTG 诱导时的3%尽管乳糖的诱导效果也不及IPTG, 诱导过程也比IPTG复杂的多, 但乳糖所具备的无毒与价廉的优点, 对工业化发酵生产重组蛋白具有重要的意义八、发酵培养发酵步骤113基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件3.培养条件的培养条件的选择：：（1）溶解氧　大肠杆菌的各个生长过程需要氧气的参与, 溶解氧浓度对菌体的生长和产物的形成影响很大。

￿尤其在高密度发酵中期, 菌体呈指数扩增, 耗氧量极大, 如果供氧不足会导致大量乙酸生成, 蛋白合成受到抑制, 菌体生长速率下降,甚至发生自溶￿（2）pH 值　发酵过程中培养液的￿pH 值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标, 是一项重要的发酵参数在培养过程中保持￿pH 的相对稳定有利于大肠杆菌的生长和重组蛋白的合成八、发酵培养发酵步骤114基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件（3）温度　温度会影响各种酶的活性, 是影响工程菌生长代谢、重组产物形成和质粒稳定性的重要因素￿对于大肠杆菌化学表达系统, 一般认为在较高的温度下进行诱导, 因为较高的温度有利于细菌的生长, 可以获得较高的生物量八、发酵培养发酵步骤115基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件4.补料方法的料方法的选择：：      工业上对微生物的培养主要有分批培养、连续培养以及改进的分批补料培养等几种方式, 其中分批补料培养是获得高浓度生物量最有效的方法￿葡萄糖因价廉易得, 容易利用且起效快, 已广泛用作重组度高密度发酵的补料基质￿但大肠杆菌在过量葡萄糖的条件下会发生“￿葡萄糖效应”￿, 积累大量乙酸, 影响重组菌的生长和外源蛋白的表达。

￿因此合理添加碳源使葡萄糖效应降到最低, 是大肠杆菌高密度发酵成功的关键八、发酵培养发酵步骤116基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件（1）非反馈补料法　非反馈补料法是目前常用的补料方法,按流加速度的不同, 可分为恒速流加补料法、变速流加补料法和指数流加补料法￿其中指数流加补料法是一种较为成熟的补料方法￿指数流加补料法是根据在指数生长期内菌体数目呈指数增加, 可以同时指数流加营养物质, 保证菌体以恒定的比生长速率生长的一种补料方法八、发酵培养发酵步骤117基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件（2）反馈补料法　由于非反馈补料法的补料程序都是预先设定的, 如果微生物的生长方式与预想不一致时, 非反馈补料法不能对其进行有效的调节, 容易使营养物质积累导致乙酸的生成反馈补料法是指依据菌体代谢时会产生某种特殊物质(如乙酸, 二氧化碳等)使发酵中一些参数发生变化, 可以根据参数的变化, 判断菌体代谢状况进行补料￿由于反馈补料法能够根据反馈的信息及时调整补料的速率和策略, 从而能够很好地控制系统的营养浓度, 防止营养浓度过高, 故被广泛应用于工程菌的高密度培养。

八、发酵培养发酵步骤118基因工程制胰岛素生工版高密度高密度发酵影响条件酵影响条件 （2）反馈补料法①恒￿pH 值补料法￿当营养充足时, 菌体利用营养物质产酸和CO2, 导致培养液￿pH 下降;当营养不足时菌体利用大量氮源产生碱性物质, 导致￿pH 值上升￿因而可以把￿pH 值的变化作为需要补料的标志, 通过补充合适的补料培养基, 维持培养液￿pH 值在一个合适的值, 进行恒￿pH 补料②恒溶解氧补料法￿当营养充足时, 菌体会大量利用营养物质生长代谢, 同时消耗大量的氧, 导致溶解氧下降;当营养物质不足时, 菌体代谢强度下降, 耗氧量也减少, 导致溶氧上升￿所以可以把溶解氧的变化作为控制补料的指标, 通过补充合适的补料培养基, 维持培养液溶解氧值在一个合适的值,进行恒溶氧补料八、发酵培养发酵步骤119基因工程制胰岛素生工版谢谢！120基因工程制胰岛素生工版。