第6章分子生物学研究法(下).ppt

第第6章章 分子生物学研究法分子生物学研究法(下下)——基因功能研究技术基因功能研究技术教学目的：教学目的： 1. 熟悉基因表达研究技术的原理和流程熟悉基因表达研究技术的原理和流程 2. 熟悉基因敲除的原理和类型熟悉基因敲除的原理和类型 3. 熟悉基因芯片技术的原理和工作流程熟悉基因芯片技术的原理和工作流程 4. 了解利用酵母来鉴定靶基因的功能了解利用酵母来鉴定靶基因的功能教学重点：教学重点： 各种技术的基本原理和流程各种技术的基本原理和流程1 1第第6章章 分子生物学研究法分子生物学研究法(下下)——基因功能研究技术基因功能研究技术 6.1 基因表达研究技术基因表达研究技术 6.2 基因敲除技术基因敲除技术 6.3 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术 6.4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析 6.5 利用酵母鉴定靶基因功能利用酵母鉴定靶基因功能 6.6 其他分子生物学技术其他分子生物学技术2 26.1 基因表达研究技术基因表达研究技术Ø转转录录组组 广广义义上上指指在在特特定定生生理理条条件件或或环环境境下下，，一一个个细细胞胞、、组组织织或或生生物物体体中中转转录录出出来来的的所所有有RNA的的集集合，包括合，包括mRNA、、rRNA、、tRNA、、sRNA。

Ø狭义上特指细胞中转录出来的所有狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNAØ通通过过特特定定生生理理条条件件下下细细胞胞内内mRNA的的丰丰度度来来描描述述基基因因表表达达水水平平并并外外推推到到最最终终蛋蛋白白质质产产物物的的丰丰度度，，是目前基因表达研究的基本思路是目前基因表达研究的基本思路Ø转转录录组组研研究究的的基基本本方方法法包包括括基基因因芯芯片片技技术术和和转转录录组测序技术组测序技术6.1.1 转录组测序转录组测序3 31)表达序列标签测序表达序列标签测序(EST)Ø原理：原理：üEST是是从从一一个个随随机机选选择择的的cDNA克克隆隆进进行行5 端端和和3 端端单单向向一一次次测测序序获获得得的的短短的的cDNA部部分分序序列列，，代代表表一一个个完完整整基基因因的的一一小小部部分分，，在在数数据据库库中中其其长长度度一一般般从从20到到7000bp不等，平均长度为不等，平均长度为360±120bpüEST来来源源于于一一定定环环境境下下一一个个组组织织总总mRNA所所构构建建的的cDNA文文库库，，因因此此EST也也能能说说明明该该组组织织中中各各基基因因的的表表达达水平。

水平Ø操作流程：操作流程：ü组组织织样样品品mRNA的的提提取取→逆逆转转录录合合成成cDNA→构构建建cDNA文库文库→测序4 42)基因表达系列分析基因表达系列分析(SAGE)Ø原理原理:üSAGE是是通通过过快快速速和和详详细细分分析析成成千千上上万万个个EST来来寻寻找找出出表表达丰富度不同的达丰富度不同的SAGE标签序列标签序列ü通通过过限限制制性性酶酶切切可可以以产产生生非非常常短短的的cDNA标标签签，，并并通通过过PCR扩增和连接，随后对连接体进行测序扩增和连接，随后对连接体进行测序Ø操作流程：操作流程：ü以寡聚以寡聚dT为引物反转录合成为引物反转录合成cDNA，，用用锚定酶酶切锚定酶酶切ü将将cDNA等分为等分为A和和B两部分，分别连接接头两部分，分别连接接头A或接头或接头B每一种接头都含有标签酶酶切位点序列每一种接头都含有标签酶酶切位点序列.ü用标签酶酶切产生连有接头的短用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接片段，混合并连接两个两个cDNA池的短池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物片段，构成双标签后，以引物A和和B扩增ü用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序。

用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序ü对标签数据进行处理对标签数据进行处理5 56 63)转录组高通量测序转录组高通量测序(RNA-Seq)Ø原理：原理：ü所所有有的的高高通通量量测测序序技技术术都都能进行能进行RNA测序ü对对cDNA进进行行高高通通量量测测序序，，以以获获得得来来不不同同mRNA片片段段在特定样本中的含量在特定样本中的含量ü各各种种类类型型的的转转录录本本都都可可以以进行高通量检测进行高通量检测Ø操作流程：操作流程：ü样品样品RNA准备准备ücDNA文库构建文库构建üDNA成簇扩增成簇扩增ü高通量测序高通量测序ü数据分析数据分析7 76.1.2 RNA的选择性剪接技术的选择性剪接技术ØRNA的的选选择择性性剪剪接接是是指指用用不不同同的的剪剪接接方方式式从从一一个个mRNA前体产生不同的前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程剪接异构体的过程Ø选选择择性性剪剪接接可可分分为为：：平平衡衡剪剪切切、、5 选选择择性性剪剪切切 、、 3 选选 择择 性性 剪剪 切切 、、外外显显子子遗遗漏漏型型剪剪切切及及相相互排斥型剪切互排斥型剪切Ø常常用用RT-PCR法法研研究究某某个个基基因因是是否否存存在在选选择择性性剪切。

剪切8 89 910106.1.3 原位杂交技术原位杂交技术Ø原原位位杂杂交交技技术术(ISH)是是用用标标记记的的核核酸酸探探针针，，经经放放射射自自显显影影或或非非放放射射检检测测体体系系，，在在组组织织，，细细胞胞、、间间期期核核及及染染色色体体上上对对核核酸酸进进行行定定位位和和相相对对定定量量研研究究的的一种手段一种手段Ø原位杂交分为原位杂交分为RNA原位杂交和染色体原位杂交原位杂交和染色体原位杂交ØRNA原原位位杂杂交交 组组织织切切片片中中，，对对特特定定基基因因的的表表达达产产物物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析在细胞水平上作出定性定量分析Ø染染色色体体原原位位杂杂交交也也称称为为荧荧光光原原位位杂杂交交(FISH) 可可确确定特定的定特定的DNA序列在染色体上的位置序列在染色体上的位置1111Ø原理：原理：ü利利用用核核酸酸分分子子单单链链之之间间有有互互补补的的碱碱基基序序列列，，将将有有放放射射性性或或非非放放射射性性的的外外源源核核酸酸(即即探探针针)与与组组织织、、细细胞胞或或染染色色体体上上待待测测DNA或或RNA互互补补配配对对，，结结合合成成专专一一的的核核酸酸杂杂交交分分子子，，经经一一定定的的检检测测手手段段将将待待测测核核酸酸在在组组织织、、细细胞胞或或染染色色体上的位置显示出来。

体上的位置显示出来Ø操作流程：操作流程：ü以经过标记的已知核酸分子为探针以经过标记的已知核酸分子为探针ü以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子ü在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交ü再对其探测再对其探测1212131314146.1.4 基因定点突变技术基因定点突变技术Ø通通过过改改变变基基因因特特定定位位点点核核苷苷酸酸序序列列来来改改变变所所编编码码的的氨氨基基酸酸序序列列，，用用于于研研究究某某个个(些些)氨氨基基酸酸残残基基对对蛋蛋白白质结构、催化活性以及结合配体能力的影响质结构、催化活性以及结合配体能力的影响Ø基基因因定定点点突突变变也也可可用用于于改改造造DNA调调控控元元件件特特征征序序列列、、修饰表达载体、引入新的酶切位点等修饰表达载体、引入新的酶切位点等Ø寡寡核核苷苷酸酸介介导导的的基基因因突突变变指指用用含含有有突突变变碱碱基基的的寡寡聚聚核核苷苷酸酸片片断断作作为为引引物物，，在在聚聚合合酶酶的的作作用用下下启启动动DNA分子进行复制分子进行复制Ø目目前前，，在在基基因因序序列列中中进进行行定定点点突突变变，，主主要要采采用用两两种种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法。

方法，重叠延伸技术和大引物诱变法15151)寡核苷酸定点突变寡核苷酸定点突变Ø原理：原理：ü合合成成一一段段寡寡聚聚脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸作作为为引引物物，，其其中中含含有有需需要要改变的碱基，使其与带有目的基因的单链改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对ü合合成成的的寡寡聚聚核核苷苷酸酸引引物物除除短短的的错错配配区区外外，，与与目目的的基基因因完完全互补ü用用DNA聚聚合合酶酶使使寡寡聚聚核核苷苷酸酸引引物物延延伸伸，，完完成成单单链链DNA的的复制ü由由此此产产生生的的双双链链DNA，，一一条条链链为为野野生生型型亲亲代代链链，，另另一一条条为突变型子链为突变型子链ü将将获获得得的的双双链链分分子子通通过过转转导导导导入入宿宿主主细细胞胞，，并并筛筛选选出出突突变体，其中基因已被定向修改变体，其中基因已被定向修改1616Ø操作流程：操作流程：ü合成一段含有需要改变碱基的寡聚核苷酸引物合成一段含有需要改变碱基的寡聚核苷酸引物ü构构建建含含靶靶序序列列的的单单链链重重组组M13DNAü用用DNA聚聚合合酶酶延延伸伸诱诱变变寡寡核核苷苷酸酸引引物物，，形形成成杂杂合合双双链链M13DNA。

ü转转染染大大肠肠杆杆菌菌，，筛筛选选携携带带突变体克隆的突变体克隆的M13噬菌斑ü纯纯化化突突变变体体，，序序列列序序列列分分析验证17172)重叠延伸重叠延伸PCR诱变法诱变法Ø原理：原理：ü对对于于两两个个具具有有部部分分重重叠叠序序列列的的DNA片片段段，，在在经经过过变变性性和和复复性性后后，，两两个个DNA片片段段之之间间通通过过同同源源序序列列形形成成部部分分杂杂合合的的双双链链，，在在DNA聚聚合合酶酶作作用用下下，，杂杂合合双双链链可可互互为为引引物物和和模板，引导模板，引导DNA的合成，从而形成杂合的合成，从而形成杂合DNA双链Ø操作流程：操作流程：ü将将DNA模板分别与引物对模板分别与引物对1和引物对和引物对2退火ü通过通过PCR1和和PCR2扩增出两种靶基因片段扩增出两种靶基因片段üFMR2和和RMF2片段在重叠区发生退火片段在重叠区发生退火ü用用DNA聚合酶补平缺口，形成长链聚合酶补平缺口，形成长链DNA，，PCR3扩增ü用引物用引物F2和和R2扩增出带有突变位点的全长扩增出带有突变位点的全长DNA片段181819193)大引物大引物PCR诱变法诱变法Ø首首先先用用正正向向突突变变引引物物(M)和和反反向向引引物物(R1)扩扩增增模模板板DNA产生双链大引物产生双链大引物(PCR1)。

Ø将将双双链链大大引引物物(PCR1)与与野野生生型型DNA分分子子混混合合后后退退火并使之复性火并使之复性Ø第第二二轮轮PCR中中加加入入正正向向引引物物(F2)，，与与PCR1中中的的互互补链配对，扩增产生带有突变的双链补链配对，扩增产生带有突变的双链DNAØ由由于于F2的的退退火火温温度度显显著著高高于于M和和R1，，可可忽忽略略引引物物M和和R1在本轮反应中所造成的干扰在本轮反应中所造成的干扰Ø获获得得定定点点突突变变PCR产产物物后后，，进进行行DNA序序列列分分析析以以验证突变位点验证突变位点20202121ØPCR介导的定点突变方法的优势：介导的定点突变方法的优势：ü突变体回收率高；突变体回收率高；ü能用双链能用双链DNA作为模板，可在任何位点引入突变；作为模板，可在任何位点引入突变；ü可在同一试管中完成所有反应；可在同一试管中完成所有反应；ü快速简便；快速简便；ØPCR介介导导的的定定点点突突变变方方法法已已成成为为定定点点突突变变的的主主要技术22226.2 基因敲除技术基因敲除技术Ø经经典典遗遗传传学学是是从从一一个个突突变变体体的的表表型型出出发发，，研研究究其其基基因型，进而找出该基因的编码序列。

因型，进而找出该基因的编码序列Ø现现代代遗遗传传学学(反反向向遗遗传传学学)首首先先从从基基因因序序列列出出发发，，推推测其表现型，进而推导出该基因的功能测其表现型，进而推导出该基因的功能Ø基基因因敲敲除除又又称称基基因因打打靶靶，，通通过过外外源源DNA与与染染色色体体DNA之之间间的的同同源源重重组组，，进进行行精精确确的的定定点点修修饰饰和和基基因因改改造造，，具具有有专专一一性性强强、、染染色色体体DNA可可与与目目的的片片段段共共同稳定遗传等特点同稳定遗传等特点6.2.1 基本原理基本原理2323Ø基因敲除为完全基因敲除和条件型基因敲除基因敲除为完全基因敲除和条件型基因敲除Ø完完全全基基因因敲敲除除 指指通通过过同同源源重重组组法法完完全全消消除除细细胞胞或者动物个体中的靶基因活性或者动物个体中的靶基因活性Ø条条件件型型基基因因敲敲除除 指指通通过过定定位位重重组组系系统统实实现现特特 定时间和空间的基因敲除定时间和空间的基因敲除Ø噬噬菌菌体体的的Cre/Loxp系系统统、、Gin/Gix系系统统，，酵酵母母细细胞胞的的FLP/FRT系系统统和和R/RS系系统统是是现现阶阶段段常常用用的的四种定位重组系统。

四种定位重组系统ØCre/Loxp系统应用最为广泛系统应用最为广泛24241)完全基因敲除完全基因敲除Ø采采用用取取代代型型或或插插入入型型载载体体在在胚胚胎胎干干细细胞胞中中根根据据正正-负筛选原理进行完全基因敲除负筛选原理进行完全基因敲除Ø正正向向选选择择基基因因neo(新新霉霉素素抗抗性性基基因因)通通常常被被插插入入载载体体靶靶DNA功功能能最最关关键键的的外外显显子子中中，，或或通通过过同同源源重重组法置换靶基因的功能区组法置换靶基因的功能区Ø负负向向选选择择基基因因HSV-tk(单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒胸胸苷苷激激酶酶基基因因)则则被被置置于于目目的的片片段段外外侧侧，，含含有有该该基基因因的的重重组组细细胞胞不能在选择培养基上生长不能在选择培养基上生长Ø如如果果细细胞胞中中发发生生了了随随机机重重组组，，负负向向选选择择基基因因就就可可能被整合到基因组中，导致细胞死亡能被整合到基因组中，导致细胞死亡Ø用用分分子子筛筛选选技技术术对对细细胞胞系系进进行行验验证证，，确确定定是是否否敲敲除了目的基因除了目的基因252526262)条件型基因敲除条件型基因敲除Ø构构建建条条件件型型基基因因敲敲除除打打靶靶载载体体，，将将正正向向选选择择标标记记neo置置于于靶靶基基因因的的内内含含子子中中，，并并在在靶靶基基因因重重要要功功能能域两侧内含子中插入同向域两侧内含子中插入同向LoxP位点。

位点Ø需需要要消消除除靶靶基基因因活活性性时时，，与与带带有有Cre重重组组酶酶基基因因的的ES细细胞胞杂杂交交，，Cre可可把把两两个个LoxP位位点点间间的的DNA片片段切除，导致靶基因失活段切除，导致靶基因失活ØCre重重组组酶酶是是细细菌菌噬噬菌菌体体P1的的I型型拓拓扑扑异异构构酶酶，，催催化化LoxP位点间的位点间的DNA进行位点特异性重组进行位点特异性重组 Ø也也可可用用Cre表表达达质质粒粒转转染染中中靶靶ES细细胞胞，，通通过过重重组组将两个将两个LoxP位点间的位点间的neo抗性基因删除抗性基因删除272728286.2.2 高等动物基因敲除技术高等动物基因敲除技术Ø胚胚胎胎干干细细胞胞(ES细细胞胞)分分离离和和体体外外培培养养的的成成功功奠奠定定了了哺乳动物基因敲除的技术基础哺乳动物基因敲除的技术基础Ø真真核核生生物物基基因因敲敲除除的的技技术术路路线线主主要要包包括括构构建建重重组组基基因因载载体体，，用用电电穿穿孔孔、、显显微微注注射射等等方方法法把把重重组组DNA导导入入胚胚胎胎干干细细胞胞纯纯系系中中，，使使外外源源DNA与与胚胚胎胎干干细细胞胞基基因因组组中中相相应应部部分分发发生生同同源源重重组组，，将将重重组组载载体体中中的的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。

序列整合到内源基因组中并得以表达Ø显微注射命中率较高，技术难度相对大些显微注射命中率较高，技术难度相对大些Ø电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便292930306.2.3 植物基因敲除技术植物基因敲除技术ØT-DNA插插入入失失活活技技术术是是目目前前在在植植物物中中使使用用最最为为广广泛泛的基因敲除手段的基因敲除手段Ø利利用用根根癌癌农农杆杆菌菌T-DNA介介导导转转化化，，将将带带有有报报告告基基因因的的DNA序序列列整整合合到到基基因因组组DNA上上，，如如果果这这段段DNA插插入入到到目目的的基基因因内内部部或或附附近近，，就就会会影影响响该该基基因因的的表表达，从而使该基因达，从而使该基因“失活失活”Ø在在该该基基因因内内部部或或附附近近插插入入了了一一段段已已知知序序列列的的DNA，，可设计引物将被破坏了的靶序列可设计引物将被破坏了的靶序列PCR扩增出来扩增出来Ø将将靶靶基基因因两两端端的的引引物物LP、、RP及及插插入入载载体体上上的的引引物物LB在同一体系在同一体系PCR扩增，可得扩增，可得3种类型的条带种类型的条带313132326.3 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术Ø酵酵母母单单杂杂交交系系统统是是上上世世纪纪90年年代代中中发发展展起起来来的的研研究究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术。

蛋白质之间相互作用的新技术Ø该该技技术术可可识识别别稳稳定定结结合合于于DNA上上的的蛋蛋白白质质，，在在酵酵母母细细胞胞内内研研究究真真核核生生物物中中DNA-蛋蛋白白质质之之间间的的相相互互作作用用，，并并通通过过筛筛选选DNA文文库库直直接接获获得得靶靶序序列列相相互互作用蛋白的编码基因作用蛋白的编码基因Ø将将已已知知顺顺式式作作用用元元件件构构建建到到最最基基本本启启动动子子(Pmin)的上游，把报告基因连接到的上游，把报告基因连接到Pmin下游6.3.1 酵母单杂交系统酵母单杂交系统3333Ø将将编编码码待待测测转转录录因因子子cDNA与与已已知知酵酵母母转转录录激激活活结结构构域域(AD)融融合合表表达达载载体体导导入入酵酵母母细细胞胞，，该该基基因因产产物物如如果果能能够够与与顺顺式式作作用用元元件件相相结结合合，，就就能能激激活活Pmin启动子，使报告基因得到表达启动子，使报告基因得到表达343435356.3.2 酵母双杂交系统酵母双杂交系统Ø核核生生物物转转录录调调控控因因子子具具有有组组件件式式结结构构特特征征，，这这些些蛋蛋白白往往往往由由两两个个或或两两个个以以上上相相互互独独立立的的结结构构域域构构成成，，其其中中DNA结结合合结结构构域域(BD)和和转转录录激激活活结结构构域域(AD)是转录激活因子发挥功能所必须的。

是转录激活因子发挥功能所必须的ØBD能能与与特特定定基基因因启启动动区区结结合合，，但但不不能能激激活活基基因因转转录录，，由由不不同同转转录录调调控控因因子子的的BD和和AD所所形形成成的的杂杂合蛋白却能行使激活转录的功能合蛋白却能行使激活转录的功能Ø先先用用基基因因重重组组技技术术将将编编码码已已知知蛋蛋白白的的DNA序序列列连连接接到到带带有有酵酵母母转转录录调调控控因因子子(GAL1、、GAL4)DNA BD编码区的表达载体上编码区的表达载体上3636Ø导导入入酵酵母母细细胞胞中中使使之之表表达达带带有有DNA结结合合结结构构域域的的杂杂合合蛋蛋白白，，与与报报告告基基因因上上游游的的启启动动调调控控区区相相结结合合，，将将作为作为“诱饵诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物捕获与已知蛋白相互作用的基因产物Ø再再将将已已知知编编码码AD的的DNA分分别别与与待待筛筛选选的的cDNA文文库库中中不不同同插插入入片片段段相相连连，，获获得得“猎猎物物”载载体体，，转转化化含含有有“诱饵诱饵”的酵母菌的酵母菌Ø如如果果酵酵母母细细胞胞表表达达的的“诱诱饵饵”蛋蛋白白与与“猎猎物物”载载体体表表达达的的某某个个蛋蛋白白质质发发生生作作用用，，不不同同转转录录调调控控因因子子的的AD和和BD就会靠拢，激活报告基因表达。

就会靠拢，激活报告基因表达Ø分分离离有有报报告告基基因因活活性性的的酵酵母母菌菌，，得得到到所所需需的的“猎猎物物”载体，就能得到与已知蛋白质作用的新基因载体，就能得到与已知蛋白质作用的新基因373738386.3.3 蛋白质相互作用技术蛋白质相互作用技术Ø将将诱诱饵饵蛋蛋白白结结合合于于葡葡聚聚糖糖表表面面并并固固定定于于纳纳米米级级厚厚度度的的金金属属膜膜上上当当蛋蛋白白质质混混合合物物经经过过时时，，如如果果有有蛋蛋白白质质同同“诱诱饵饵”蛋蛋白白发发生生相相互互作作用用，，那那么么两两者者的的结结合合将将使使金金属属膜膜表表面面的的折折射射率率上上升升，，导导致致共共振振角度的改变角度的改变1)等离子表面共振技术等离子表面共振技术(SPR)Ø共共振振角角度度的的改改变变与与该该处处蛋蛋白白质质浓浓度度成成线线性性关关系系由由此此可可检检测测蛋蛋白白质质之之间间的的相互作用相互作用39392)免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术(CoIP)Ø将将靶靶蛋蛋白白的的抗抗体体连连接接到到固体基质上固体基质上Ø再再将将可可能能与与靶靶蛋蛋白白发发生生相相互互作作用用的的待待筛筛选选蛋蛋白白加入反应体系中。

加入反应体系中Ø用用低低离离心心力力沉沉淀淀或或微微膜膜过过滤滤法法在在固固体体基基质质和和抗抗体体的的共共同同作作用用下下将将蛋蛋白白复复合合物物沉沉淀淀到到试试管管的的底底部或微膜上部或微膜上40403)GST及及GAD融合蛋白沉降技术融合蛋白沉降技术ØGST融融合合蛋蛋白白是是将将谷谷胱胱甘甘肽肽S转转移移酶酶(GST)与与目目标标蛋白做成融合蛋白的方式在外源表达蛋白做成融合蛋白的方式在外源表达Ø利利用用GST对对谷谷胱胱甘甘肽肽偶偶联联的的琼琼脂脂糖糖球球珠珠的的亲亲和和性性，，从从混混合合蛋蛋白白质质样样品品中中纯纯化化得得到到相相互作用蛋白互作用蛋白ØGST沉沉降降应应用用于于确确定定探探针针蛋蛋白白与与未未知知蛋蛋白白以以及及探探针针蛋蛋白白与与已已知知蛋白间的相互作用蛋白间的相互作用4141ØGAD融融合合蛋蛋白白是是由由酵酵母母转转录录调调控控因因子子(Gal4)的的转转录录激激活活结结构构域域(GAD)与与植植物物色色素素相相互互作作用用因因子子(PIF3)构成Ø将将GAD与与PIF3的的不不同同区区段段相相接接成成为为诱诱饵饵，，研研究究该该重重组组蛋蛋白白在在体体外外与与光光敏敏素素B(phy B)与与缺缺失失N-37位位氨基酸的突变体或光敏素氨基酸的突变体或光敏素(phy A)的相互作用。

的相互作用Ø光光敏敏素素B能能与与PIF3发发生生强强烈烈的的相相互互作作用用，，超超过过30%的的phy B被被PIF3沉淀下来沉淀下来Ø缺缺失失N-37位位氨氨基基酸酸的的phy B突突变变体体及及phy A只只能能与与PIF3发发生生较较弱弱的的作作用用，，约约5%的的phy A或或约约10%的的N-37位氨基酸缺失突变的位氨基酸缺失突变的phy B被沉淀下来被沉淀下来42424)荧光共振能量转移法荧光共振能量转移法(FRET) ØFRET用于细胞内蛋白质的相互作用研究用于细胞内蛋白质的相互作用研究ØFRET荧光能量转移有三个基本条件：荧光能量转移有三个基本条件：ü给体与受体在合适的距离给体与受体在合适的距离(1~10nm)；；ü给给体体的的发发射射光光谱谱与与受受体体的的吸吸收收光光谱谱有有一一定定的的重重叠叠(这这是是能量匹配的条件能量匹配的条件)；；ü给给体体与与受受体体的的偶偶极极具具有有一一定定的的空空间间取取向向(这这是是偶偶极极-偶偶极耦合作用的条件极耦合作用的条件)ØFRET需需要要有有两两个个探探针针，，即即荧荧光光给给体体和和荧荧光光受受体体，，要要求求给给体体的的发发射射光光谱谱与与受受体体的的吸吸收收光光谱谱有有一一定定的的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。

重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠Ø不不同同蛋蛋白白的的吸吸收收和和发发射射波波长长不不同同，，可可根根据据需需要要组组成不同的探针对成不同的探针对4343Ø常用的探针有常用的探针有3类：类：ü荧荧光光蛋蛋白白 一一类类能能发发射射荧荧光光的的天天然然蛋蛋白白及及其其突突变变体体常常见见的的有有绿绿色色(GFP)、、蓝蓝色色(BFP)、、青青色色(CFP)和和黄黄色色(YFP)荧光蛋白等荧光蛋白等ü有有机机染染料料 具具有有特特征征吸吸收收和和发发射射光光谱谱的的有有机机化化合合物物组组成成的的染染料料对对包包括括荧荧光光素素、、罗罗丹丹明明类类化化合合物物和和青青色色染染料料Cy3、、Cy5等 ü镧镧系系染染料料(金金属属染染料料) 一一般般与与有有机机染染料料联联用用，，分分别别作作为为FRET的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比44446.3.4 染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术(ChIP) ØChIP是是一一种种在在体体内内研研究究DNA与与蛋蛋白白质质相相互互作作用用的的方方法法ChIP不不仅仅可可以以检检测测体体内内反反式式因因子子与与DNA的的动动态态作作用用，，还还可可以以用用来来研研究究组组蛋蛋白白的的各各种种共共价价修修饰与基因表达的关系。

饰与基因表达的关系ØChIP流程流程(见见P226图图6-30)：： ü在活细胞状态下固定蛋白质在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物ü超声或酶切处理将其随机切成染色质小片段超声或酶切处理将其随机切成染色质小片段ü通过抗原抗体的特异识别反应，沉淀该复合物通过抗原抗体的特异识别反应，沉淀该复合物ü富集与目的蛋白质结合的富集与目的蛋白质结合的DNA片段ü对目的对目的DNA片段进行纯化和片段进行纯化和PCR检测45456.3.5 RNA干涉技术及其应用干涉技术及其应用ØRNA干干涉涉(RNAi)技技术术是是利利用用双双链链小小RNA高高效效、、特特异异性性降降解解细细胞胞内内同同源源mRNA从从而而阻阻断断靶靶基基因因表表达达，，使细胞出现靶基因缺失的表型使细胞出现靶基因缺失的表型Ø双双链链RNA是是RNAi的的触触发发物物，，引引发发与与之之互互补补的的单单链链RNA(ssRNA)的降解Ø经经过过Dicer(一一种种具具有有RNAase III活活性性的的核核酸酸酶酶)的的加加工工，，细细胞胞中中较较长长的的双双链链RNA(30个个核核苷苷酸酸以以上上)首首先先被被降降解解形形成成21~25个个核核苷苷酸酸的的小小分分子子干干扰扰核核糖糖核酸核酸(siRNA)，并有效地定位目标，并有效地定位目标mRNA。

4646ØsiRNA是是引引发发转转录录后后基基因因沉沉默默中中序序列列特特异异性性RNA降降解解的的重重要要中中间间媒媒介介，，它它具具有有特特殊殊的的结结构构特特征征，，即即5 端端磷磷酸酸基基团团和和3 端端的的羟羟基基，，其其两两条条链链的的3 端各有两个碱基突出于末端端各有两个碱基突出于末端Ø由由siRNA中中的的反反义义链链参参与与指指导导合合成成被被称称为为RNA诱诱导导的的沉沉默默复复合合体体(RISC)的的核核蛋蛋白白体体，，再再由由RISC介介导导切切割割目目的的mRNA分分子子中中与与siRNA反反义义链链互互补补的的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能区域，从而实现干扰靶基因表达的功能Ø哺哺乳乳动动物物细细胞胞内内，，较较长长的的双双链链RNA(dsRNA)会会导导致致非非特特异异性性基基因因沉沉默默，，只只有有21~25个个核核苷苷酸酸的的siRNA才能有效引发特异性基因沉默才能有效引发特异性基因沉默Ø非哺乳动物可用较长非哺乳动物可用较长dsRNA直接诱导产生直接诱导产生RNAi474748486.4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析Ø核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。

核酸杂交技术是基因芯片应用的基础Ø基基因因芯芯片片(DNA chip)，，又又称称DNA芯芯片片，，是是指指将将许许多多特特定定的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段或或基基因因片片段段作作为为探探针针，，有有规规律律地排列固定于支持物上地排列固定于支持物上Ø然然后后与与待待测测的的标标记记样样品品的的基基因因按按碱碱基基配配对对原原理理进进行行杂杂交交，，再再通通过过激激光光共共聚聚焦焦荧荧光光检检测测系系统统等等对对芯芯片片进进行扫描6.4.1 基因芯片技术原理基因芯片技术原理Ø并并配配以以计计算算机机系系统统对对每每一一探探针针上上的的荧荧光光信信号号进进行行比比较较和和检检测测，，而迅速得出所要的信息而迅速得出所要的信息49496.4.2 基因芯片的点制过程基因芯片的点制过程Ø基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列Ø制制作作简简易易基基因因芯芯片片时时，，用用机机械械臂臂把把DNA片片段段点点在在玻玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固化璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固化Ø也也可可以以直直接接在在玻玻璃璃板板表表面面进进行行化化学学合合成成，，从从而而得得到到寡聚核苷酸芯片。

寡聚核苷酸芯片Ø将将芯芯片片与与待待研研究究的的cDNA或或其其它它样样品品杂杂交交，，经经过过计计算算机机扫扫描描和和数数据据处处理理，，便便可可以以观观察察到到大大规规模模的的基基因因群群在在不不同同组组织织或或同同一一组组织织不不同同发发育育时时期期或或不不同同生生理理条件下的表达调控情况条件下的表达调控情况1)简易基因芯片简易基因芯片50502)大规模基因芯片大规模基因芯片Ø简简易易芯芯片片一一般般基基因因数数量量少少(一一般般不不超超过过2000)，，主主要要用用于于研研究究小小部部分分特特定定基基因因的的表表达达状状态态可可用用手手工制作或者机械手点样工制作或者机械手点样Ø大大规规模模基基因因芯芯片片通通常常涉涉及及基基因因组组规规模模与与数数量量大大(一一般般大大于于10000个个基基因因)，，分分别别采采用用接接触触式式点点样样，，非非接触式点样或者半导体技术制备样品接触式点样或者半导体技术制备样品Ø基基因因芯芯片片技技术术包包括括四四个个主主要要步步骤骤：：芯芯片片制制备备、、样样品制备、杂交反应、信号检测和结果分析品制备、杂交反应、信号检测和结果分析51515252Ø基因芯片的工作流程：基因芯片的工作流程：ü经大规模经大规模PCR扩增获得独立扩增获得独立cDNA片段。

片段ü用机械手将用机械手将PCR产物点在合适的介质上，变性、固定产物点在合适的介质上，变性、固定ü从不同器官或组织中分离从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成，反转录生成cDNAü用不同的荧光染料标记不同的用不同的荧光染料标记不同的cDNA样本ü将标记后的将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交与点好的芯片进行杂交ü激光扫描芯片杂交结果，计算机处理激光扫描芯片杂交结果，计算机处理ü分析芯片杂交数据分析芯片杂交数据·PCR扩增扩增·靶基因标记靶基因标记·原位合成原位合成·合成点样合成点样芯片杂交芯片杂交杂交检测杂交检测数据分析数据分析实际应用实际应用提出问题提出问题芯片设计芯片设计芯片制作芯片制作试样处理试样处理·表达差异分析表达差异分析·多态性分析多态性分析·再测序再测序·生物信息学生物信息学·数学优化数学优化·数据库数据库·标准化标准化53536.4.3 基因芯片数据分析基因芯片数据分析Ø数据可靠性分析：数据可靠性分析：ü通通过过两两次次平平行行杂杂交交反反应应，，将将每每个个基基因因在在两两个个反反应应中中的的表表达达水水平平做做成成对对应应散散点点图图，，只只要要绝绝大大多多数数基基因因的的杂杂交交结结果果都在都在45º斜线附近，就说明实验结果是可靠的。

斜线附近，就说明实验结果是可靠的ü用用多多个个管管家家基基因因作作为为内内对对照照，，管管家家基基因因的的反反应应信信号号在在两两种组织中不变，可确定其他基因表达信号的相对值种组织中不变，可确定其他基因表达信号的相对值Ø生物学意义分析生物学意义分析ü分析芯片杂交数据，研究差异表达基因的生物学意义分析芯片杂交数据，研究差异表达基因的生物学意义ü将将差差异异表表达达定定位位于于不不同同的的生生物物化化学学代代谢谢途途径径，，研研究究基基因因芯片数据中可能具有生物学意义的代谢途径芯片数据中可能具有生物学意义的代谢途径54546.5 利用酵母鉴定靶基因功能利用酵母鉴定靶基因功能Ø酵酵母母菌菌是是单单细细胞胞真真核核生生物物，，具具有有与与动动植植物物细细胞胞相相似的结构特征似的结构特征Ø酿酿酒酒酵酵母母有有稳稳定定的的单单倍倍体体和和二二倍倍体体细细胞胞，，是是最最早早完成基因组完成基因组DNA全序列测定的真核生物全序列测定的真核生物Ø导导入入酵酵母母细细胞胞中中的的DNA即即能能以以自自主主复复制制的的分分子子形形式存在，也可被整合到基因组的方式存在式存在，也可被整合到基因组的方式存在Ø酵酵母母中中转转化化DNA的的整整合合重重组组主主要要通通过过同同源源重重组组方方式进行，整合效率较高。

式进行，整合效率较高6.5.1 酵母的遗传学和分子生物学简介酵母的遗传学和分子生物学简介5555Ø酵母单倍体和二倍体的重大差异：酵母单倍体和二倍体的重大差异：ü二倍体细胞直径大约是单倍体的二倍体细胞直径大约是单倍体的1.3倍ü二倍体细胞呈长形或卵圆形，单倍体通常接近圆形二倍体细胞呈长形或卵圆形，单倍体通常接近圆形ü二倍体细胞按极性方向出芽，单倍体按轴线方向出芽二倍体细胞按极性方向出芽，单倍体按轴线方向出芽Ø酵母细胞有三种交配型：酵母细胞有三种交配型：ü单倍体单倍体 MATa；；MATαü二倍体二倍体 MATa/αØMATa与与MATα交配形成交配形成MATa/αØMATa/α不能与不能与MATa或或MATα交配Ø二二倍倍体体酵酵母母细细胞胞在在营营养养缺缺乏乏的的条条件件下下能能通通过过减减数数分分裂裂形形成成单单倍倍体体的的孢孢子子从从单单个个孢孢子子来来源源的的所所有有细细胞胞都带有一套相同的染色体都带有一套相同的染色体DNA565657576.5.2 酵母基因转化与性状互补酵母基因转化与性状互补Ø利利用用整整合合型型质质粒粒(Yip)可可以以对对酵酵母母基基因因组组中中的任意基因进行精确的敲除的任意基因进行精确的敲除(置换置换) 。

Ø带带有有致致死死位位点点和和可可能能的的外外源源功功能能互互补补基基因因的的酵酵母母二二倍倍体体细细胞胞在在饥饥饿饿条条件件下下形形成成四四分分体体孢孢子，通过四分体分析技术进行观测和研究子，通过四分体分析技术进行观测和研究Ø如如果果引引入入的的外外源源基基因因具具有有互互补补突突变变点点的的功功能能，，含含有有突突变变基基因因的的单单倍倍体体可可以以存存活活，，否否则则就就不不能存活58586.5.3 外源基因在酵母中的功能鉴定外源基因在酵母中的功能鉴定Ø将将外外源源基基因因克克隆隆于于酵酵母母表表达达载载体体上上，，转转化化野野生生型型或或突突变变酵酵母母菌菌株株，，通通过过观观察察酵酵母母的的表表型型变变化化或或分分析析细细胞胞中中化化学学成成分分的的变变化化即即可可推推测测该该基基因因的生物学功能的生物学功能Ø酵酵母母细细胞胞中中有有与与动动植植物物细细胞胞接接近近的的蛋蛋白白质质转转录录后后修修饰饰系系统统，，许许多多在在大大肠肠杆杆菌菌中中不不能能产产生生功功能能蛋蛋白白质质的的动动植植物物基基因因在在酵酵母母中中表表达达后后往往往往具具有有生物学功能生物学功能59596.6 其他分子生物学技术其他分子生物学技术Ø凝凝胶胶滞滞缓缓(EMSA)技技术术是是用用于于体体外外研研究究DNA与与蛋蛋白白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。

质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术Ø基本原理：基本原理：ü在在凝凝胶胶电电泳泳中中，，由由于于电电场场的的作作用用，，裸裸露露的的DNA朝朝正正电电极移动的距离与其分子量的对数成反比极移动的距离与其分子量的对数成反比ü如如果果DNA分分子子与与某某种种蛋蛋白白质质相相结结合合，，导导致致分分子子量量增增大大，，在在凝凝胶胶中中的的迁迁移移作作用用受受到到阻阻滞滞，，在在特特定定电电压压和和时时间间内内朝正电极移动的距离也就相应缩短了朝正电极移动的距离也就相应缩短了6.6.1 凝胶滞缓实验凝胶滞缓实验6060Ø方法：方法：同位素标记待测的同位素标记待测的DNA片段片段细胞提取物细胞提取物DNA-蛋白质复合物蛋白质复合物探针探针DNA温育温育PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影进行进行DNA凝胶分析凝胶分析 61616.6.2 噬菌体展示技术噬菌体展示技术Ø噬噬菌菌体体是是细细菌菌病病毒毒的的总总称称噬噬菌菌体体可可被被分分为为溶溶菌菌周期和溶源周期两种不同的类型周期和溶源周期两种不同的类型Ø只具有溶菌生长周期的噬菌体称为烈性噬菌体只具有溶菌生长周期的噬菌体称为烈性噬菌体Ø具有溶源周期的噬菌体称为温和噬菌体。

具有溶源周期的噬菌体称为温和噬菌体Ø基本原理：基本原理：ü将将编编码码“诱诱饵饵”蛋蛋白白的的DNA片片段段插插入入噬噬菌菌体体基基因因组组，，与编码噬菌体外壳蛋白的基因相融合与编码噬菌体外壳蛋白的基因相融合ü重重组组噬噬菌菌体体侵侵染染宿宿主主细细菌菌后后，，复复制制形形成成大大量量带带有有杂杂合合外外壳壳蛋蛋白白的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒，，直直接接用用于于捕捕获获靶靶蛋蛋白白库库中中与与“诱饵诱饵”相互作用的蛋白质相互作用的蛋白质6262Ø噬菌体展示技术的基本流程：噬菌体展示技术的基本流程：63636.6.3 蛋白质磷酸化分析技术蛋白质磷酸化分析技术Ø细细胞胞的的生生长长发发育育、、周周期期调调控控、、基基因因表表达达、、蛋蛋白白质质合合成成、、神神经经活活动动、、肌肌肉肉收收缩缩等等都都离离不不开开蛋蛋白白质质特特异性磷酸化或去磷酸化异性磷酸化或去磷酸化Ø由由蛋蛋白白激激酶酶和和蛋蛋白白磷磷酸酸酯酯酶酶所所催催化化的的蛋蛋白白质质可可逆逆磷磷酸酸化化过过程程，，是是生生物物体体内内普普遍遍而而重重要要的的调调控控方方式式，，控制着众多的生理生化反应和生物学过程控制着众多的生理生化反应和生物学过程。

Ø蛋蛋白白激激酶酶催催化化ATP或或GTP的的γ-磷磷酸酸基基团团转转移移到到底底物物蛋蛋白白的的丝丝氨氨酸酸、、酪酪氨氨酸酸、、苏苏氨氨酰酰残残基基上上，，使使底底物蛋白磷酸化物蛋白磷酸化Ø蛋白磷酸酯酶催化磷酸化的底物蛋白去磷酸化蛋白磷酸酯酶催化磷酸化的底物蛋白去磷酸化64646565Ø蛋蛋白白质质磷磷酸酸化化分分析析技技术术主主要要是是对对底底物物磷磷酸酸化化和和蛋蛋白激酶活性进行检测白激酶活性进行检测Ø用双向电泳及质谱分析检测底物蛋白磷酸化用双向电泳及质谱分析检测底物蛋白磷酸化Ø细细胞胞内内的的蛋蛋白白激激酶酶多多达达上上千千个个，，体体内内检检测测某某个个蛋蛋白激酶活性非常困难白激酶活性非常困难Ø用体外激酶活性分析法检测蛋白激酶的活性用体外激酶活性分析法检测蛋白激酶的活性Ø体体外外激激酶酶活活性性分分析析技技术术主主要要包包括括获获得得底底物物蛋蛋白白和和待测蛋白激酶，进行蛋白质体外磷酸化反应待测蛋白激酶，进行蛋白质体外磷酸化反应Ø体体外外激激酶酶活活性性分分析析法法能能可可靠靠地地鉴鉴定定某某个个蛋蛋白白激激酶酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。

666667676.6.4 蛋白质免疫印迹与抗体制备蛋白质免疫印迹与抗体制备Ø印印迹迹法法(blotting)是是指指将将样样品品转转移移到到固固相相载载体体上上，，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法Ø1975年年，，Southern建建立立了了将将DNA转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜(NC膜膜)上上，，并并利利用用DNA-RNA杂杂交交检检测测特特定定的的DNA片段的方法，称片段的方法，称Southern印迹法印迹法Ø后来对后来对RNA的印迹分析称的印迹分析称Northern印迹法印迹法Ø对单向电泳后蛋白质的印迹分析称对单向电泳后蛋白质的印迹分析称Western印迹法印迹法Ø对双向电泳后蛋白质的印迹分析称对双向电泳后蛋白质的印迹分析称Eastern印迹法印迹法1)蛋白质免疫印迹蛋白质免疫印迹(Western blotting)6868蛋白质免疫印迹的基本原理：蛋白质免疫印迹的基本原理：Ø将将通通过过PAGE分分离离的的蛋蛋白白质质转转移移到到NC膜膜或或PVDF膜上Ø然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应。

Ø洗涤去除没有结合的特异性抗体后洗涤去除没有结合的特异性抗体后Ø加加入入标标记记的的、、能能识识别别特特异异性性抗抗体体的的种种属属特特异异性性抗抗体体，，反反应应一一段段时时间间后后再再次次洗洗涤涤去去除除非非特特异异性性结结合合的标记抗体的标记抗体Ø加加入入适适合合标标记记物物的的检检测测试试剂剂进进行行显显色色或或发发光光等等，，观察有无特异性蛋白条带的出现观察有无特异性蛋白条带的出现6969蛋白质免疫印迹的基本步骤：蛋白质免疫印迹的基本步骤：Ø固固定定：：蛋蛋白白质质进进行行聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(PAGE)并并从从胶上转移到硝酸纤维素膜上胶上转移到硝酸纤维素膜上Ø封封闭闭：：保保持持膜膜上上没没有有抗抗体体的的结结合合场场所所，，使使场场所所处处于于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上Ø一抗杂交：一抗杂交：初级抗体初级抗体(第一抗体第一抗体)是特异性的是特异性的Ø二二抗抗杂杂交交：：第第二二抗抗体体或或配配体体试试剂剂对对于于初初级级抗抗体体是是特特异性结合并作为指示物异性结合并作为指示物Ø底底物物显显色色：：被被适适当当保保温温后后的的酶酶标标记记蛋蛋白白质质区区带带，，产产生可见的、不溶解状态的颜色反应。

生可见的、不溶解状态的颜色反应707071712)抗体制备抗体制备Ø利利用用抗抗原原刺刺激激机机体体，，使使其其产产生生免免疫疫反反应应，，由由机机体体的的浆浆细细胞胞合合成成并并分分泌泌能能与与抗抗原原特特异异结结合合的的一一组组免免疫球蛋白疫球蛋白，称为，称为抗体抗体Ø用用单单一一抗抗原原决决定定簇簇刺刺激激机机体体，，由由一一个个B淋淋巴巴细细胞胞克克隆接受该抗原所产生的抗体称为隆接受该抗原所产生的抗体称为单克隆抗体单克隆抗体Ø由由多多种种抗抗原原决决定定簇簇产产生生的的一一组组针针对对各各个个抗抗原原决决定定簇的混合抗体称为簇的混合抗体称为多克隆抗体多克隆抗体Ø抗抗体体制制备备过过程程：：①①准准备备抗抗原原，，②②选选择择动动物物，，③③动动物物免免疫疫，，④④效效价价检检测测，，⑤⑤采采集集血血清清、、纯纯化化抗抗体体，，⑥⑥对于抗体进行纯度及特异性鉴定对于抗体进行纯度及特异性鉴定72726.6.5 细胞定位及染色技术细胞定位及染色技术Ø真核细胞具有复杂的亚细胞结构真核细胞具有复杂的亚细胞结构Ø每种细胞器都有一组特定的蛋白每种细胞器都有一组特定的蛋白Ø蛋蛋白白质质在在细细胞胞内内的的定定位位是是分分子子生生物物学研究的重要话题。

学研究的重要话题Ø常用的定位方法是免疫荧光法和荧光蛋白标记法常用的定位方法是免疫荧光法和荧光蛋白标记法Ø绿绿色色荧荧光光蛋蛋白白(GFP)由由238个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，，最最大大吸吸收收峰峰为为395 nm(紫紫外外)，，并并有有一一个个479 nm的的副副峰峰(蓝蓝光光)；发射光谱最大峰值为；发射光谱最大峰值为509 nm(绿光绿光)ØGFP的的第第65、、66、、67位位氨氨基基酸酸分分别别是是丝丝氨氨酸酸、、脱脱氢氢酪氨酸、甘氨酸，构成其生色团的核心酪氨酸、甘氨酸，构成其生色团的核心7373GFP融合蛋白的构建：融合蛋白的构建：Ø应应用用亚亚克克隆隆技技术术，，将将目目的的基基因因与与GFP基基因因构构成成融融合基因Ø通通过过愈愈伤伤组组织织转转化化法法、、基基因因枪枪、、显显微微注注射射、、电电激激转化等方法转化到合适的细胞转化等方法转化到合适的细胞Ø利利用用目目的的基基因因的的表表达达调调控控机机制制，，如如启启动动子子和和信信号号序列来控制融合基因的表达序列来控制融合基因的表达Ø最终得到的融合蛋白，并对目的蛋白进行定位最终得到的融合蛋白，并对目的蛋白进行定位。

Ø要尽可能的不影响目的蛋白的定位和功能要尽可能的不影响目的蛋白的定位和功能目的基因目的基因gfp 基因基因融合基因融合基因转化转化表达表达检测检测7474提提 要要Ø应应用用转转录录组组测测序序、、原原位位杂杂交交和和基基因因芯芯片片等等技技术术来来研研究究单单个个或或多多个个基基因因在在生生物物体体某某个个特特定定发发育育阶阶段段或或不不同环境下的表达模式同环境下的表达模式Ø应应用用基基因因定定点点突突变变、、基基因因敲敲除除、、RNA干干涉涉等等技技术术抑抑制制全全部部或或部部分分基基因因的的表表达达，，通通过过靶靶基基因因缺缺失失后后的的表表型变化和来研究基因的功能型变化和来研究基因的功能Ø应应用用酵酵母母的的单单杂杂交交、、双双杂杂交交、、四四分分体体等等技技术术来来研研究究蛋白质之间以及蛋白质与蛋白质之间以及蛋白质与DNA之间的相互作用之间的相互作用Ø通通过过活活体体和和离离体体蛋蛋白白质质之之间间相相互互作作用用的的研研究究，，为为认认识信号转导、蛋白质修饰加工等提供技术支持识信号转导、蛋白质修饰加工等提供技术支持7575思思 考考 题题P243第第2、、5、、6、、11题。