细胞培养实验写报告内容.doc

细胞培养实验写报告内容 1目的2 原理3材料与方法（操作步骤）4实验结果5结论或结果分析 实验一 鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养 实验二 滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）实验三 Hep-2细胞的传代培养实验四 VSV TCID50滴定实验五 干扰素活性（效价）的测定 实验六 VSV中和试验（稀释血清固定病毒法）实验二 鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养一、目的1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；2、掌握活细胞的显微镜下观察；3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法二、原理离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能生存、生长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，比如肌肉细胞的收缩功能；上皮细胞的分泌功能等通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等的研究 三、材料（按2人/组的量发放）名 称数 量备 注9～11日龄鸡胚1只无菌器械1套无菌无毒平皿2只5或10ml吸管4支1或5ml吸管1支青霉素瓶（带塞）2只Hank s’ 液250ml1640 RMPI或DMEM500ml双抗5ml胰蛋白酶1ml小牛血清5ml5.6% NaHCO33ml碘酒和酒精棉球若干细胞培养瓶2只四、操作步骤1、在DMEM和Hank’s 液中分别无菌操作以1％的量加入双抗，吸出10～15mlHank’s 液至无菌平皿中备用； 2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳；3、取出两只无菌平皿，并标记①和②，待用。

4、大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳； 5、消毒镊子后小心撕破卵膜，两人互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平皿①中，小心去头、内脏、爪和粘液及血球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平皿②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于大青霉素瓶中，在火焰附近用无菌眼科剪刀将其剪成约0.5～1mm3的小块（约250次），此时体积约0.5ml；用Hank s’ 液洗涤两次7、按照10倍量加入0.25％胰蛋白酶，调节pH至约7.3～8.0（肉眼观为肉红色）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃水浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化消化停止的标志是：轻轻晃动后细胞悬起，呈云雾状，很快聚集成团，表明细胞活力好9、消化结束后，取出，稍沉淀，缓慢吸出上清，用Hank’s 液小心洗涤2～3次，可以尽量减少胰蛋白酶的残留量，然后加入DMEM液约5ml，用小头吸管充分吹打，使细胞充分分散吸上清；重复操作3～4次，收集细胞上清10、（1）上述细胞悬液自然沉降，待未消化彻底的组织块沉入瓶底后，收集上清，并加入足量的小牛血清（终浓度为10％），将细胞密度调到约1×106个/ml。

2）经四层无菌纱布过滤后收集滤液，并加入足量的小牛血清（终浓度为10％），将细胞密度调到约1×106个/ml；11、将上述制备好的细胞悬液平均分配到2只细胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞，注意生长面朝下，在非生长面上做好标记，包括细胞名称，接种培养时间，组别及姓名等12、细胞统一置于本室指定的CO2孵箱中培养13、24h后观察细胞生长情况，如果细胞长成单层，细胞界限清晰，大多数细胞为梭形并贴壁，布满细胞瓶的生长面，说明细胞生长状态良好实验三 滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）一、实验目的掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法二、实验原理原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等研究 病毒在细胞内增殖的检测指标有细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、干扰现象、免疫荧光法检测等由病毒引起的细胞病变称细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），常见的细胞形态学变化为细胞变圆、聚集、融合、裂解或脱落等三、实验材料（按2人/组的量发放）名 称数 量备 注200TCID50 VSV0.1ml5ml和1ml吸管各1支维持液100ml含3％小牛血清的RPMI-1640液或DMEM液四、操作步骤1、上述原代成纤维细胞培养24h后，一旦细胞完全贴壁生长良好后，则轻弃培养上清，换上细胞维持液（含3％小牛血清的RPMI-1640），接种200TCID50的VSV0.1ml，在细胞瓶上标记换液时间，接种病毒量。

正常对照也按照上述方法换上维持液2、再继续培养，每间隔12～24h观察，直至全部细胞出现明显的病变，显微镜观察细胞脱落，圆缩，则可停止培养3、收集全班的病毒培养物于100ml无菌盐水瓶中，写好标记，置于－20℃冰箱充分冷冻后再置于4℃冰箱或室温下解冻，该过程称为冻融反复冻融三次后，细胞膜破坏，释放出胞内病毒低速离心，弃细胞碎片沉渣，收集上清即为病毒悬液留样测定病毒的TCID50五、实验结果1、鸡胚原代成纤维细胞的显微镜下观察2、VSV攻击鸡胚原代成纤维细胞后，细胞病变效应（CPE）的观察3、病毒收获的方法实验四 Hep-2细胞的传代培养一、目的掌握细胞传代培养的方法及其应用二、原理原代培养后由于细胞游出数量增加，细胞进行增殖，单层培养细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离再培养称之为传一代细胞培养传代根据不同细胞采取不同的方法贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

三、材料名 称数 量备 注传代人喉癌上皮细胞（Hep-2）1瓶/2人VTP1ml/2人DMEM液100ml/2人PBS1瓶/8人血清5ml/2人5或10ml吸管2支1ml吸管1支细胞培养瓶1只/2人四、操作步骤1、将细胞生长面朝上轻轻倒掉上清，用PBS小心洗涤三次，注意吸管尖头不要伸到细胞瓶中2、用上述吸管吸取1ml VTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约3～5min当细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，即可停止消化，尽可能弃尽消化液，继续利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱落下来为止3、加入少量DMEM液细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞充分使细胞均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫吸一滴细胞悬液于Ep管中4、计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量0.04％台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡计算细胞密度用DMEM制备成1×106/ml的细胞悬液，并按10％的量加入小牛血清5、将上述细胞悬液分装5ml到新细胞瓶中，塞好塞子，送培养箱培养，24h后观察。

以备实验五、六、七用实验五 VSV TCID50滴定（注：此实验和实验五、六同时进行）一、目的掌握病毒TCID50滴定的基本原理和计算方法以及应用二、原理多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（cytopathic effect，CPE），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得以识别和判断CPE的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力即能在细胞培养板孔或试管内引起半数细胞发生病变所需的病毒量定义为病毒的组织细胞感染指数（tissue culture infection dose，TCID50） 测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清将待测病毒用维持液做10倍稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般48h即可；VSV增殖也较快，因此，48h~72h也可以观察、染色、计算三、 材料与器材名 称数 量备 注Hep-2细胞实验五传代所得，自备/组水泡性口炎病毒（VSV）自备/组维持液，PBS，VTP自备/组细胞板1块/组tip头4盒/组微量移液器自备四、 操作步骤1、制备细胞：方法同实验五。

一瓶细胞消化后加入8ml营养液即可制成所需细胞悬液密度约为1×106/ml用微量移液器将细胞悬液加入40或96孔板微孔中，每孔100μl，37℃，5%CO2孵育箱培养24h，形成单层，做病毒滴定用2、50%组织细胞感染量（TCID50）测定（a）稀释病毒液：取无菌小试管或青霉素瓶9支，各管分别加3%小牛血清的维持液2.7ml，然后向第一管加VSV病毒液0.3ml，反复吹吸混合三次，从第一管内吸液0.3ml加入第二管内，反复混合三次，从第二管内吸液0.3ml加入第三管内，反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续10倍稀释，使病毒稀释为10-1，10-2，10-3…10-9b）病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的VSV病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加2孔，每孔100μl细胞对照孔不加病毒液，只加维持液置37℃，5%CO2孵育箱中孵育c）结果观察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置显微镜下观察CPE，病毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落现象表示细胞正常；“+”25%细胞产生病变、圆缩、破碎脱落；“2+”50%细胞产生病变；“3+”75%细胞产生病变；“4+”100%细胞产生病变。

实验时，观察24h~48h即可染色计算）3、计算TCID50参见下表：表1 VSV在Hep-2细胞上的TCID50结果记录病毒稀释度病变孔数/接种孔数累积数（孔）病变细胞孔有病变↑无病变↓比例百分比（%）10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/380按表中，10-3稀释的病变高于50%；10-4稀释的病变低于50%；50%。