餐厨废油脂高效利用菌种及其产物的研究（.doc

餐厨废油脂高效利用菌种及其产物的研究* 基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103）第一作者简介：李泳诗（1994.1-），女，研究方向为生物技术李泳诗，许进莉，陈盈盈，梁燕萍，黄静怡，刘敏玲，李秋霞，曾丽娟广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了利用餐厨废油脂制备生物表面活性剂，从长期受餐厨废油脂污染的土壤中筛选生物表面活性剂高产菌种在研究过程中，主要对土壤样品进行平板初筛和摇瓶发酵复筛，对优选菌种进行菌体形态特征、生理生化特征和16S rDNA等方面的鉴定，对优选菌种发酵产物进行分离纯化、临界胶束浓度分析和乳化活性分析获得1株高效的菌种NH26，被鉴定为皮氏罗尔斯顿菌菌种NH26的纯化产物经薄层层析显色分析和傅立叶红外光谱分析，被确定为脂肽类生物表面活性剂该生物表面活性剂的临界胶束浓度为126 mg/L，能够使水的表面张力下降至22.465 mN·m-1在临界胶束浓度下，该生物表面活性剂对花生油、大豆油、菜籽油、玉米油、煤油和柴油的乳化率均大于50%关键词：餐厨废油脂；高效利用；生物表面活性剂；菌株Study on strain of high ability of utilizing waste cooking oil and characteristics of its productLI Yong-shi, XU Jin-li, CHEN Ying-ying, LIANG Yan-ping, HUANG Jing-yi, LIU Min-ling, LI Qiu-xia, ZENG Li-juan, DENG Mao-cheng, CHEN Wei-xin, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to produce biosurfactant (BS) from waste cooking oil, strains having the ability to generate biosurfactant were isolated and screened from the soil sample with long time contaminated by waste cooking oil. During the study process, initial screen with flat and repeat screen with shake flask fermentation were applied. The systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis was carried out. At the same time, separation and purification means, critical micelle concentration (CMC) analysis and emulsifying activity analysis (E24) of the fermentation product with preferred strain were conducted on. A high producing biosurfactant strain NH26 was obtained and identified as Ralstonia pickettii. Purified product of NH26 was identified as lipopeptide biosurfactant by thin layer chromatograph (TLC) color reaction and fourier transform infrared (FT-IR) spectrum analysis. The critical micelle concentration of the lipopeptide was 126 mg/L and this moment could lower the surface tension of lipopeptide solution to 22.465 mN/m. The emulsification rates (E24) of this lipopeptide against to different oils, including peanut oil, soybean oil, vegetable seeds oil, corn oil, kerosene and diesel oil were measured and all exceeded by 50% under the CMC.Key words：waste cooking oil；high utilization；biosurfactant；strain引言餐厨废油脂是人们在餐厨活动、食品加工等过程中产生的废弃油脂、油水混合物以及经过处理的“地沟油”[1]。

据估计，我国食用油脂的年消费量达2250万吨左右，重返餐桌的“地沟油”约有300万吨[2]国家已经明令禁止餐厨废油脂重返餐桌、食品工业、饲料工业以及涉及食物链的领域但是，餐厨废油脂是一种具有利用性很强的特殊废弃物，国内外研究人员高度关注餐厨废油脂的回收利用，并在利用它制备生物柴油、化工原料等领域取得一些研究成果[3] 生物表面活性剂是由微生物代谢产生的表面活性剂，它具有化学表面活性剂无法比拟的优点，如无毒或低毒性、生物可降解性、对长链烃类化合物的优良乳化性以及环境友好性[4]迄今为止，生物表面活性剂已在日用化工品生产、石油三次开采、环境污染治理等领域得到应用[5]据报道，一些烃类化合物降解微生物往往能够产生生物表面活性剂[6]，但以餐厨废油脂制备生物表面活性剂仍然少有报道为了高效地利用餐厨废油脂制备生物表面活性剂，我们开展了高效菌种的筛选工作，并对发酵产物的特性进行了初步分析1 材料与方法1.1 材料 餐厨废油脂：采集某火锅店的废弃油脂，经水分去除的处理，作为培养基的碳源；筛选样品：在广东轻工职业技术学院南海校区内选定一个小区域土地(直径约为20cm)，每天以少量餐厨废油脂浇淋，经5个月的自然培养，采集土壤作为菌种筛选样品。

1.2 富集培养与平板分离 富集培养基：废油脂20 g/L，蛋白胨 5 g/L，NH4Cl 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 5 g/L，调节pH7.0平板培养基：NH4NO3 1.5 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L，调节pH7.0斜面培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 10 g/L，琼脂 20 g/L，调节pH7.0以上培养基的灭菌条件：121 °C灭菌20 min 称取10 g土壤样品，放入200 mL的富集培养基中，于30 °C、200 rpm的条件下培养24 h然后，用无菌水对培养液进行梯度稀释，涂布于分离平板上，在将等量的无菌废油脂涂布在分离平板上，于30 °C培养48 h用无菌的竹签挑取菌落，接入斜面培养基，于30 °C培养20 h，放入4 °C冰箱进行保藏，备用1.3 生物表面活性剂产生菌的筛选 种子培养基：葡萄糖 20 g/L，酵母膏 10 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，调节pH7.0。

摇瓶发酵培养基：废油脂40 g/L，蛋白胨 2 g/L，NH4Cl 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 5 g/L，调节pH7.0以上培养基的灭菌条件：121 °C灭菌20 min 将各菌株的斜面菌种接入种子培养基，于30 °C、200 rpm的条件下培养12 h然后，按10%的接种量，将种子培养液接入发酵培养基，于同样条件下培养48 h调节发酵液的pH至8.0，于12000 rpm下离心20 min，将清液置于分液漏斗中，静置30 min，取下部的液体，采用A101型全自动表面张力仪（美国科诺工业有限公司）分别测定表面张力，并检测它对煤油的乳化率根据表面张力和对煤油的乳化率，优选生物表面活性剂产生菌1.4 优良菌种的鉴定 菌种经革兰氏染色，用普通显微镜观察菌体形态用扫描电镜观察菌体，并进行摄像[4]根据《Bergy’s Manual of Determinative for Bacteriology》介绍的方法[7]，对菌种进行生理生化试验参考文献介绍的分子生物学鉴定方法[8]，对菌种进行16S rDNA鉴定。

1.5 生物表面活性剂的提取与纯化 调节发酵液的pH至8.0，于12000 rpm下离心20 min，再调节pH至2.0，静置于4 °C下12 h，再经离心分离，收集沉淀物[9]预先将200目硅胶装填在玻璃层析柱(Ф25×400 mm)内，称取10 g 沉淀物，溶于甲醇，与少量的200目硅胶拌匀，装入玻璃层析柱顶部，依次用氯仿、氯仿/甲醇(10:1)的混合液、氯仿/甲醇(8:1)的混合液、氯仿/甲醇(6:1)的混合液、氯仿/甲醇(4:1)的混合液、氯仿/甲醇(2:1)的混合液、甲醇进行洗脱，各种洗脱液的体积为200 mL，洗脱速度为1 mL/min，收集氯仿/甲醇混合液洗脱过程的流出液，每20 mL收集1管，于紫外分光光度计上扫描吸收值最大的波长，合并相同的流出液采用旋转真空蒸发仪，蒸发去除各种流出液的溶剂，得到各种组分将各种组分配制成1 g/L的溶液，测定表面张力，选择表面张力最低的组分进行进一步的分析1.6 薄层层析与显色分析 将1.6中优选的组分点样于硅胶薄板上，采用氯仿/甲醇/水为65/25/4的展开剂进行层析[9]，烘干，置于115 °C下进行原位硫酸水解24 h。

然后，分别采用茚三酮显色剂、苯酚-硫酸显色剂和碘蒸汽显色剂进行喷雾，烘干，观察显色情况[4]如果有显色，根据显色斑点测定Rf值1.7 傅立叶红外光谱分析 将上述制备所得的组分与KBr混匀，经7000 kg的压力制成片剂，置于傅立叶红外光谱仪上扫描，扫描区间为4000 cm-1-400 cm-1，根据红外吸收光谱分析生物表面活性剂的官能团[10]1.8 临界胶束浓度的分析 将上述制备所得的组分配制成梯度浓度的溶液，采用表面张力仪测定表面张力，以测量值绘制曲线，分析临界胶束浓度(CMC)1.9 乳化活性的分析 将上述制备所得的组分配制成CMC，分别与等体积的花生油、大豆油、菜籽油、玉米油、煤油和柴油进行混合，经激烈振荡3 min，静置24 h，测量乳化率1.10 表面张力的测定方法 利用表面张力仪，采用铂金环法测量溶液的表面张力[4]1.11 乳化率的测定方法 吸取被乳化的物质5 mL，加入具刻度试管，然后加入5 mL生物表面活性剂溶液，于3000 rpm的蜗旋振荡仪上振荡3 min，在室温环境中静置24 h，测量乳化层高度和总液层高度，按下式计算乳化率(。