激光扫描共聚焦显镜(课堂PPT).ppt

激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)1产地：德国型号：Leica激光扫描共聚焦显微镜 TCS SP5 2一、LSCM的发展历程二、LSCM的基本结构三、LSCM的工作原理四、LSCM的基本功能 五、LSCM 的优越性六、LSCM在医学及生物学研究中的应用七、激光扫描共聚焦显微镜技术教学实验 3一、LSCM的发展简史•激光扫描共聚焦显微镜是目前生物学领域应用最广泛和图像分辨率最高的实验仪器，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，已成为形态学、分子细胞生物学、材料科学等诸多领域中有力的研究工具4•1957年，Malwin Minsky在他的专利中首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理•10年后，Egger第一次成功地用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面，所用的共聚焦显微镜的核心是尼普科夫盘(Nipkon disks)，此盘位于光源和针孔之后，从盘射出的光束以连续的光点在盘旋转时照射到物体上，但该技术当时尚不完善。

•1970  年，Sheppard  和Wilson推荐了一种新型的激光扫描共聚焦显微镜，同时首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学•1978年，Brankenhoff发明了高数值孔径的透镜•1979年，Koester设计了一种共聚焦扫描狭缝器并获得美国专利1985年，Wijanedts第一次成功地用激光扫描共聚焦显微镜演示了用荧光探针标记的生物材料的光学横断面•至此，激光扫描共聚焦显微镜技术已基本发展到了一个较为成熟的阶段 5二、LSCM的基本结构•激光扫描共聚焦显微镜主要由：   1、光学显微镜部分；   2、激光发射器（本院的LSCM使用三个激光器：氩离子激光器：488nm， 氦氖绿激光器：543nm，氦氖红激光器：633nm，这三个激光器可做三通道荧光标记，可使用绝大多数常见的绿、红或远红外激发）；   3、扫描装置（ 检测针孔光栅、分光镜、发射荧光分色器等 ）；   4、光检测器（ 高灵敏度的光电倍增管(PMT)，电压越高，则光信号转换成的电信号越强，可将荧光图像的强度按照0~255 分级显示 ）；   5、计算机系统 (包括数据采集、处理、转换、应用软件)；   6、图像输出设备六部分组成。

67三、LSCM的工作原理•激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡，由探测针孔后的光电倍增管逐点接受，在计算机监视器屏幕上形成荧光图像所以照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，也就是说照明针孔与探测针孔具有共同的焦平面在载物台上加一个微量步进马达，使载物台沿垂直方向(Z 轴) 上下步进移动，将样品新的一个层面移到焦平面上，这个层面又成像在显示器上，随着Z 轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光学图像，实现“光学切片” 的目的, 被形象地称为“显微CT”, 在此基础上计算机系统自动进行三维重建 8图  显示 LSCM的结构示意图9四、LSCM的基本功能 （1）多荧光探针标记样品高清晰度、高分辨率图像的采集；（2）无损伤连续光学切片图像的采集— 显微“CT”；（3）三维图像重建；（4） 时间序列扫描： XYt 、XYZt 和 Xt 扫描，通常指共聚显微镜系统沿着时间轴对活体细胞和活体组织内被标记物变化的动态跟踪；   (5)  感兴趣区域的扫描；（6）定位、定量测定；（7）图像处理。

 主要功能：1.  对活细胞进行无损伤性的实时观察分析，进行形态和功能相结合的研究2.  对活细胞和组织或细胞组织切片进行连续断层扫描，能获得细胞的各个精细层面结构3.  荧光标记探针标记的活细胞或切片标本的细胞生物物质，膜标记、细胞示踪、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察； 4.  细胞内离子荧光标记，单标记或多重标记，检测细胞内如pH和钠、钾、钙、镁等离子浓度的比率测定及其动态变化 10五、 LSCM 的优越性 1、动态连续扫描及三维图像重组               LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描, 来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”LSCM扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像，与普通光学显微镜获得的图像相比，LSCM所得的重组三维图像清晰度高、立体感强,  可通过计算机软件对细胞内所研究的结构进行各种测量，对细胞内的空间结构和某些物质在细胞内的定位方面的研究中有广泛的应用  2、同时多种物质标记               利用LSCM，通过对膜上、胞浆内多种物质的荧光标记，可以实现在同一样品上同时进行多重物质的观察，比如检测细胞内钠、钙、镁等离子浓度的比率及动态变化。

  113、瞬时分辨率高              LSCM的另一大优点是瞬时分辨率高，可以实时动态观察活体组织标本LSCM 的荧光检测器可以毫秒级或微秒级的速度检测荧光，即其时间分辨率极高，能对细胞内的分子进行功能性动态观察LSCM技术可对活细胞在无损伤处理的情况下进行观察，跟踪活细胞内的物质或结构和生理过程随时间变化的情况，得到实时动态的连续图像同时，LSCM的检测灵敏性极强，还可对荧光进行精确定量分析  4、高质量数字图像               普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度﹑相干性好等优点，可以避免普通显微镜的缺点一般常用的气体激光器如氩(Ar)﹑氪(Kr)﹑氦(He)﹑氖(Ne)由于LSCM的样品焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样就避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低，图像清晰度和分辨率不高的缺点而且，LSCM的图像是以电信号的形式记录下来的，可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行各种图像处理12五、LSCM在医学及生物学研究中的应用1、观察活细胞、活组织 LSCM在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。

这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要这可以说是LSCM最大的优势；2、生化成分精确定位 观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平；133、动态观察 在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化目前在这方面做得最多的是使用LSCM观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或pH的动态变化4、数据、图像的数字化 用计算机代替了普通的照相机,得到的图像是数字化的,可及时输出或长期储存,而且还可进一步加工处理5、定量测量 首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比 14肿瘤研究中的应用肿瘤研究中的应用    1. 细胞生物学：细胞凋亡、细胞三维结构、细胞膜受体或抗原的分布,两种或三种蛋白的共定位、蛋白与细胞器的共定位等；    2. 药理学：药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量；    3. 生理学：在亚细胞水平观察Ca2+、pH值、膜电位等的动态分布及定量；    4. 遗传学：基因的染色体定位、原位杂交、基因表达、基因诊断等。

15六、激光扫描共聚焦显微镜技术教学实验六、激光扫描共聚焦显微镜技术教学实验1 1、激光扫描共聚焦显微镜系统的结构、开发、激光扫描共聚焦显微镜系统的结构、开发机操作及注意事项；机操作及注意事项； 2 2、激光共聚焦显微镜观察细胞核和线粒体膜、激光共聚焦显微镜观察细胞核和线粒体膜的定位；的定位；162、LSCM观察细胞核和线粒体膜的定位实验流程：1、取悬浮培养的对数生长期L1210细胞（密度约为：1×106个细胞/mL）;2、离心收集（2500rpm/min，5min），弃上清；3、0.01M （pH为7.0左右）的PBS洗细胞两次(2500rpm/min，5min) 弃上清；4、用500μL的PBS重悬细胞，加入1μL的线粒体荧光探针（罗丹明123）（终浓度为5 µg/mL），轻轻吹匀，37℃，避光孵育20min;5、PBS洗两次，弃上清；6、再用100μL的PBS重悬细胞，加入1μL的活细胞核荧光染料Hoechst 33324（终浓度为1 µg/mL ）；室温，避光孵育10min;7、PBS洗两次，弃上清，用50μL左右的PBS重悬细胞；8、滴片（20μL），激光共聚焦显微镜下观察。

   注：1、罗丹明123激发波长488～505nm，发射波长515～575 nm （一般为530nm）；              2、Hoechst 33342的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst   33342和双链DNA结合后，最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm 17。