激光扫描共聚焦显微--杲海霞.ppt

激光扫描共聚焦显微镜Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM)杲海霞 河北医科大学药理教研室采用激光作为光源，在传统光学显微 镜基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针， 采用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组 织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上 观察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算 机对所观察的对象进行数字图象处理的一套集 观察、分析和输出为一体系统它把光学成像 的分辨率提高了30%~40%，成为形态学，分 子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域 中新一代的研究工具LSCM 的发展 1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获得了美国的专利 1967年 成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面 1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜 1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品 1987年 White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进 行 科学研究的重要工具 随后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相继开发出不同型 号的共聚焦显微镜。

随着技术的不断发展和完善，产 品的性能也不断改进和更新，应用的范围也越来越广 泛Hippocampus neurons expressing GFPn LSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较荧光显微镜LSCMLSCM的重要组件主要系统包括激光光源、自动显 微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通 道和针孔、扫描镜、检测器）、数字 信号处理器、计算机以及图象输出设 备（显示器、彩色打印机）等激光器 显微镜：物镜 载物台 计算机系统：图像分析与控制系统激光扫描共聚焦显微镜 vs 荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜荧光显微镜激光作为光源的优点n单色性强 谱线宽度可小于10-8 nmn方向性强 发射角仅为毫弧度数量级n高亮度n相干性好 基于上述主要特点，激光作为扫描共聚焦显微镜的光源是最理想的波长功率 （mW）激光器类型 325 351 457-514 543.5 632.8 700-1100 115210-30 300 25 1.25 3.5 2000 1氦镉(He-Cd)激光器 带紫外的水冷氩离 子激光 小型氩离子激光 绿氦氖(He-Ne)激光 红氦氖(He-Ne)激光 蓝宝石激光 氦氖(He-Ne)激光激光扫描共聚焦显微镜中常见的激光器激光器显微镜Leica DM IRBE 倒置荧光显微镜物镜LSCM物镜的重要参数 NA数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。

是 物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的 重要标志N.A=n*sin a/2n：物体与物镜间媒质的折射率a\2：物镜孔径角的一半溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52， 水的为1.3，空气为1香柏油与玻璃折射率相似 ，故光折射少，透光率高，成像清楚 N.A. 越大：放大倍数越大，分辨率越高，N.A. 越大：视场宽度与工作距离越小Magnificati onNumerical ApertureWorking Distance (mm)Achromat Correction4x0.1030.0010x0.256.1020x0.402.1040x0.650.6560x0.800.30100x (oil)1.250.184x 20x 10x 40x 60x 100x 载物台计算机系统图像分析与控制系统分析软件控制软件+n 激光共聚焦显微镜原理图1. 共聚焦显微镜简化原理图用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜 (Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本 (specimen)内部焦点(focal point)处。

激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少 量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜其中携带图像信息的荧光由于 波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器 (Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电 信号后送入计算机而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射， 不会被探测到共轭图2. 探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用 ）只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平 面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝 大部分无法通过中心的小孔因此，焦平面上的观察目 标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差 增加，图像清晰在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭 conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术LSCM扫描图像方式n单一光学切片扫描 (single optical section, x-y) n时程活细胞扫描 (time lapse live cell imaging, x-y-t)n三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z)n四维扫描 (4-D imaging, x-y-z-t)ZXYXY平面单一光学切片扫描 (single optical section, x-y)Optical sections collected simultaneously at three different excitation wavelengths (488, 568, and 647 nanometers). The specimen is the fruit fly third instar wing imaginal disk. XYXY平面时程活细胞扫描 (time lapse live cell imaging, x-y-t)XY XY平面timeTime-lapse imaging of a living fruit fly embryo injected with calcium green is presented in Figure 2. The series of images shows the change in distribution of the fluorescent probe over time. 0 s10 s20 s30 s三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z)Peripheral nervous system of a fruit fly embryo ZXYXY平面三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z)一种高分辨率的显微成像技术1 用激光做光源，激光单色性好，光源波长相同， 从根本上消除了色差。

2 采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个带 有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消 除了球差，并进一步消除了色差显微图象的清 晰度和细节分辨能力 3 采用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细 小的激光束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合 成一个整体传统的光镜在场光源下一次成像， 标本上每一点都会受到相邻点的衍射光和散射光 的干扰这两种图像的清晰度和精密度是无法相 比的4 用计算机采集和处理光信号，并利用光电 倍增管放大信号，它代替了人眼和照相机 进行观察，摄像，得到的图像是数字化的 ，可以在电脑中进行处理，进一步提高图 像的清晰度 5观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤细 胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和 测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理 过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观察过 的样品还可以继续用于其他的研究这种 功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要 这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势6 生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于 要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定 位到亚细胞水平和分子水平 7 动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描, 就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化 。

目前在这方面做得最多的是使用ＬＳＣＭ观察 心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或 ｐＨ的动态变化 8 定量测量：首先应用专一的荧光探针对样品进行 染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比, 如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光 强度值,可得出特定成分的含量比 应用范围 细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动 性、受体、细胞器结构和分布变化 生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分 析 药理学：药物对细胞的作用及其动力学 生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布 动态神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运 输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、 细胞分布 微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构 病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免 疫性疾病诊断、HIV等 遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的 三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断LSCM在生物学上的应用n荧光组织化学n动态荧光测量 (细胞内钙测量、细胞内pH 测量、细胞膜流动性测量、膜电位测定)n细胞间隙连接的细胞间通讯荧光探针的选择合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实 验结果的保障。

(1)现有仪器所采用的激光器 (2)荧光探针的光稳定性和光漂白性 (3)荧光的定性或定量定性:单波长激发探针定量:双波长激发比率探针 (4)荧光探针的特异性和毒性 (5)荧光探针适用的pH* 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差 异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应 进行染料的筛选，以找出最适的荧光探针 许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进 入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯） 结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通 过质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被 非特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅 可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出 质膜，从而能有效的发挥作用常见应用及其荧光探针1．细胞内游离钙 共聚焦激光扫描显微镜常用的有Fluo-3、 Fluo-4、 Rhod-1、 Rhod-2、 Indo-1、Fura-2 等，前四者为单波长荧光探针，利用其单波长 激发特点可直接测量细胞内Ca2+动态变化， 为钙定性探针；后两者为双波长激发探针，利 用其双波长激发特点和比率技术，能定量细胞 内钙，为钙定量探针 2． DNA和RNA核酸的荧光探针 用于共聚焦激光扫描显微镜的主要有 Acridine Orange(吖啶橙，AO)、 Propidium Iodide(碘化丙啶，PI)。

两种染 料既可标记DNA又可标记RNA，如为获得 单独的DNA或RNA分布，染色前可用 RNA酶或DNA酶处理细胞PI不能进入完 整的细胞膜，故不能标记活细胞内的DNA 和RNA3． 膜电位 共聚焦激光扫描显微镜则可利用荧光探针 在细胞膜内外分布的差异测出膜电位，不但可 以观察细胞膜电位的变化结果，更重要的是可 以用于连续监测膜电位的迅速变化DiBAC4(3)：带负电荷慢反应染料本身无荧光 ，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出 荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中当细 胞内荧光强度增加即膜电位；反之，即膜电位 降低 Rhodamine 123：主要用于线粒体膜电 位测量是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线 粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与 DiBAC4(3)的表示形式相反4． 细胞内活性氧基 ：活性氧(active oxygen species)可影响细胞 代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有 些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研 究中有一定的意义。