军团菌及其检测方法ppt课件.ppt

武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌及其检测技术军团菌及其检测技术武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科Email：：2014年年11月月武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌的菌的发现l1976年年7月在美国月在美国费城，参加退伍城，参加退伍军人大会的人人大会的人员中爆中爆发了一种症状相同，原因了一种症状相同，原因不明的不明的细菌性肺炎，菌性肺炎， 有有221人感染疾病，其中死亡人感染疾病，其中死亡34人人l初步的流行病学分析初步的流行病学分析显示，致病的微生物可能通示，致病的微生物可能通过空气空气传播，采集播，采集标本，分离本，分离病原体病原体l革革兰氏阴性杆菌氏阴性杆菌——嗜肺嗜肺军团菌菌（（L. pneumophila ））l军团菌病菌病 (已知的首次爆已知的首次爆发)2武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科Part I：军团菌及菌及军团菌病菌病3武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌军团菌•革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌, ,浅红色的短杆菌，直径浅红色的短杆菌，直径0.30.3～～0.5μm0.5μm，长约，长约1.21.2～～5μm5μm或更长，菌体一端或更长，菌体一端有鞭毛有鞭毛. .•在含在含L L- -半胱氨酸和焦磷酸铁的半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYEBCYE琼脂培养琼脂培养基上生长，通常需要在基上生长，通常需要在3737℃℃ 5%5%CO2培养箱培养箱培养培养2-102-10天。

天•生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫色变为蓝色，或是灰绿色色变为蓝色，或是灰绿色初步在初步在BCYEBCYE琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样，具有多型性璃样，具有多型性. .4武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌科、属、种、血清型军团菌科、属、种、血清型u军团菌科军团菌科 (Legionellaceae (Legionellaceae ））Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadeiLegionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadei u军团菌属：军团菌属：16s rRNA16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系分析表明，在蛋白细菌系γγ亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚群与引起群与引起Q Q热病的热病的coxiella burneti(coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。

细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞u军团菌种军团菌种：现已发现：现已发现5050个种（个种（speciesspecies），），7070多个血清型（多个血清型（serogroups)serogroups)，至少有，至少有2020个个种可引起人感染种可引起人感染 5武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科种名发现时间 种名发现时间 种名发现时间 Legionella pneumophila1979Legionella maceachernii 1985Legionella geestiana 1993Legionella bozemanae 1980Legionella parisiensis 1985Legionella londiniensis 1993Legionella dumoffii 1980Legionella rubrilucens 1985Legionella nautarum 1993Legionella gormanii 1980Legionella santicrucis 1985Legionella quateirensis 1993Legionella micdadei 1980Legionella spiritensis 1985Legionella worsleiensis 1993Legionella pittsburghensis 1980Legionella steigerwaltii 1985Legionella lansingensis 1994Legionella jordanis 1982Legionella israelensis 1986Legionella lytica 1996Legionella longbeachae 1982Legionella birminghamensis1988Legionella waltersii 1996Legionella oakridgensis 1983Legionella brunensis 1989Legionella taurinensis 1999Legionella wadsworthii 1983Legionella cincinnatiensis1989Legionella beliardensis 2001Legionella feeleii 1984Legionella moravica 1989Legionella drozanskii 2001Legionella sainthelensi 1984Legionella quinlivanii 1990Legionella fallonii 2001Legionella anisa 1985Legionella tucsonensis 1990Legionella gresilensis 2001Legionella cherrii 1985Legionella adelaidensis 1991Legionella rowbothamii 2001Legionella erythra 1985Legionella fairfieldensis 1991Legionella busanensis 2003Legionella hackeliae 1985Legionella gratiana 1991Legionella drancourtii 2004Legionella jamestowniensis1985Legionella shakespearei 1992军团菌种军团菌种6武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌病7武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科Part II：：样本的采集与运本的采集与运输8武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科哪些环境中存在军团菌？9武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科标本的种类标本的种类u 环境水标本环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水：空调冷却塔水、冷凝水, ,温泉水温泉水, ,淋浴水淋浴水, , 加湿器水；加湿器水；u 病人组织标本病人组织标本: :如痰如痰, ,支气管灌洗液支气管灌洗液, ,胸水胸水, ,血液等标本。

血液等标本10武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科环境境标本采集原本采集原则Ø最初流出的水最初流出的水标本：打开水本：打开水龙头或装置后立即采集水或装置后立即采集水样，，该水水样即代表即代表设备内内的水的水Ø过后流出的水后流出的水标本：最初流出的水本：最初流出的水标本收集以后，本收集以后，让设备内的水流掉后再采集内的水流掉后再采集水水样此水代表此水代表供供给设备的水的水11武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科环境境标本采集本采集•有有杀生物生物剂时的采的采样：水：水样中含有中含有氯或其它氧化性或其它氧化性杀生物生物剂时，向采，向采样瓶中添瓶中添加适量硫代硫酸加适量硫代硫酸钾使其使其灭活对于其它的生物于其它的生物剂，加入普通的中性，加入普通的中性试剂是无效是无效的•注意：注意：样本采集到本采集到浓缩，以及，以及样本采集到本采集到浓缩培养的培养的间隔隔时间控制在控制在14天以内样本的来源，数量，有无本的来源，数量，有无杀虫虫剂都要登都要登记，并同，并同标本一起送到本一起送到实验室不知来室不知来源或不知道源或不知道处理理过程的水程的水标本是不予本是不予进行行试验的。

的12武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科常常见几种系几种系统采集部位采集部位冷水系冷水系统的采集：的采集：•进水系水系统•蓄水池蓄水池•与每个蓄水池相与每个蓄水池相连的下水道的排出口的下水道的排出口•蓄水池最蓄水池最远的下水道的排出口的下水道的排出口 对每一个装置来每一个装置来说，收集，收集500ML最初流出的水最初流出的水标本，本，让水持水持续流，并在流水中放流，并在流水中放一只温度一只温度计，待温度，待温度稳定后，收集定后，收集500ML过后流出的水后流出的水标本13武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科热水系水系统•加加热器的排出口：器的排出口：选用保用保护性的橡胶手套和其它的保性的橡胶手套和其它的保护性装性装备•关掉离加关掉离加热器最近的冷水系器最近的冷水系统•避免冷避免冷热水混合水混合•加加热器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥•排水口排水口连接一根干接一根干净的硅胶管的硅胶管 采采样方式：打开开关采集最初流出的水方式：打开开关采集最初流出的水标本。

本让水排掉至温度水排掉至温度稳定定为止再采一止再采一份份过后流出的后流出的标本，并关本，并关闭开关开关14武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科淋浴器淋浴器•收集最初流出的水收集最初流出的水标本本•如果淋浴器有一个大的如果淋浴器有一个大的莲蓬蓬头式式喷嘴，用一个干嘴，用一个干净的未用的未用过的塑料袋，的塑料袋，该装置装置包裹起来，切掉一个角，将包裹起来，切掉一个角，将该切口切口处置于接取置于接取标本容器的开口本容器的开口处15武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科冷却塔冷却塔•警告：警告：为安全起安全起见，采，采样前，前，负责供水系供水系统的工作人的工作人员应关掉冷却塔的鼓关掉冷却塔的鼓风机戴一副戴一副齐肘的橡胶手套，从池内舀水，由于机器肘的橡胶手套，从池内舀水，由于机器继续运行而不能关运行而不能关闭冷却塔冷却塔时，，则需要采需要采样人人员做出做出专门的安排，的安排，这种情况下，种情况下，应佩戴安全佩戴安全护目目镜和呼吸道防和呼吸道防护装装备•在塔的入口在塔的入口处采采样：将干：将干净的硅胶管插入瓶内，通的硅胶管插入瓶内，通过虹吸作用吸取虹吸作用吸取顶部蓄水池部蓄水池的水。

先用水充的水先用水充满管子并管子并夹住其一端，以防止管子空了管的一端放在蓄水池住其一端，以防止管子空了管的一端放在蓄水池里，另一端放在采里，另一端放在采样瓶里，使瓶内管的一端低于蓄水池管的一端松开瓶里，使瓶内管的一端低于蓄水池管的一端松开夹子，子，水开始流出，取水开始流出，取够所需的量，停止虹吸，将管从蓄水池内取出所需的量，停止虹吸，将管从蓄水池内取出16武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科•进水口水口远处采集池塘内的水：用勺子采取冷却塔，池塘表浅部位的粘泥（深度采集池塘内的水：用勺子采取冷却塔，池塘表浅部位的粘泥（深度<20cm)，用虹吸管采取池子深，用虹吸管采取池子深处的粘泥采集位于的粘泥采集位于该系系统内内滤器的水，沉淀物，器的水，沉淀物，碎碎砾等•注意：所需注意：所需样品的数量取决于品的数量取决于该系系统内的大小和地理位置如果蓄水池和水塔内的大小和地理位置如果蓄水池和水塔之之间的管道短，那么只需采集一份的管道短，那么只需采集一份标本17武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科标本的运输和相关生物安全要求标本的运输和相关生物安全要求u在周围环境温度下运送水样标本在周围环境温度下运送水样标本, ,不必冷冻不必冷冻, ,但要防止受热和阳光但要防止受热和阳光, ,标本要尽可能标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室快或最好在两天内送到实验室, ,室温下室温下(21(21+ +3℃)3℃)贮藏在实验室或其他地方。

贮藏在实验室或其他地方u对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20℃-20℃冻存备用冻存备用18武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌操作生物安全性军团菌操作生物安全性u应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定u生物安全生物安全ⅡⅡ级实验室，最好在安全柜中操作级实验室，最好在安全柜中操作u操作人员培训操作人员培训u菌种保存菌种保存19武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科《《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》》病原菌名称病原菌名称危害程度危害程度分类分类实验活动所需生物安全实验室级别实验活动所需生物安全实验室级别运输包装分类运输包装分类学名学名中文名中文名大量活菌大量活菌操作操作动物感动物感染实验染实验样本样本检测检测非感染性非感染性材料实验材料实验A/BUN 编编号号Legionella pneumophila嗜肺军团嗜肺军团菌菌第三类第三类BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-1BUN 337320武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科Part III：：军团菌的分离与菌的分离与检测21武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科水样标本中军团菌的分离方法水样标本中军团菌的分离方法检测依据依据: 《《公共场所集中空调通风系统卫生规范公共场所集中空调通风系统卫生规范》》中的集中中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录检验方法见附录B B。

适用于各种环境标本军团菌检测适用于各种环境标本军团菌检测 ，包括：，包括： 饮用饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀物、软泥等物质淀物、软泥等物质22武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科标本肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物水样血清水样处理与制备血清学检测方法：*间接荧光抗体染色法*试管凝集试验*ELISA法接种军团菌BCYE培养基接种军团菌选择性GVPC培养基37℃， 5%CO2， 培 养 3-14天挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检37℃,5%CO2,培养3-14天革兰氏染色阴性杆菌革兰氏染色阳性杆菌 纯培养 弃去 确认试验 血清玻片凝集试验 PCR检测 生化试验 尿液抗原检测23武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌水质检测概括军团菌水质检测概括1.采样采样2.浓缩浓缩3.培养培养4.分离分离5.鉴定鉴定24武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科实验所需所需仪器器设备90mm平皿平皿35~37孵箱孵箱滤器（大的不器（大的不锈钢制成的制成的滤器）器）正正压膜蠕膜蠕动过滤泵：流速可：流速可调。

3升升/分分钟注意：注意：样本量少，也可用真空本量少，也可用真空辅助的助的滤过系系统代替代替膜膜滤器：器：0.22um或或0.45um水浴水浴锅：：离心机：离心机：涡旋振旋振荡器：器：显微微镜：：25武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌检测所需准备基本试剂军团菌检测所需准备基本试剂1.1.培养基（培养基（GVPCGVPC，，BCYE,BCYE-CYS)BCYE,BCYE-CYS)2.2.试剂试剂 ( (生化试剂、甲醛的盐溶液）生化试剂、甲醛的盐溶液）3.3.酸缓冲液（酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱，碱缓冲液（冲液（0.03mol/L KOH））4.4.血清学试剂血清学试剂26武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科培养检测所需准备材料培养检测所需准备材料1.1.直径大约为直径大约为90mm90mm或或100mm100mm的无菌培养皿的无菌培养皿2.2.培养箱，培养箱，COCO2 2能够恒温保持在（能够恒温保持在（36±136±1））℃℃3.3.水浴箱，能够保持在（水浴箱，能够保持在（50±150±1））℃℃4.4.显微镜或荧光显微镜。

显微镜或荧光显微镜27武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科样品采样准备材料样品采样准备材料1.1.玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理水样一般采集为玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理水样一般采集为250-500ml250-500ml，收集在容器瓶，收集在容器瓶中2.2.如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于70℃70℃）或蒸汽进行）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于巴斯德氏消毒，时间不低于5 5分钟3.3.小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物4.4.广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖5.5.灭菌棉拭子灭菌棉拭子一般建议用塑料包装的容器一般建议用塑料包装的容器28武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌培养基菌培养基Muller-HintonMuller-Hinton琼脂第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵母抽提物替代CYECYE琼脂CYECYE琼脂加入α-α-酮戊二酸BCYEBCYE琼脂BCYEBCYE琼脂中含有选择性抗生素GVPCGVPC琼脂29武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌培养基菌培养基30武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌分离培养用菌分离培养用BCYE培养基培养基酵母浸出物酵母浸出物10.0g 活性炭活性炭2.0g琼脂脂17.0gα‐ ‐酮戊二酸戊二酸1.0g蒸蒸馏水水950 mLＬ－半胱氨酸Ｌ－半胱氨酸盐酸酸盐0.4g可溶的焦磷酸可溶的焦磷酸铁0.25gＬ－半胱氨酸和焦磷酸铁分别溶于10 mL蒸馏水，分别过滤（0.45‐μm滤器）。

将剩余培养基成分溶于950 mL蒸馏水，高压灭菌水浴冷却至50℃，加入上述过滤液10 N KOH调整pH至6.9蒸馏水补充至1L倒培养基前先摇动混匀以保持碳呈悬浮状态每平板20ml （15×100mm），斜面10ml或4ml（20×150mm或13×100mm）ACES缓冲液(2‐乙酰基‐2‐氨基乙烷磺酸) 10.0g31武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科选择性（性（GVPC）培养基的制）培养基的制备添加四种抗生素：添加四种抗生素：甘氨酸甘氨酸3g/L（（稳定定剂，防腐，防腐剂，，缓冲冲剂））多粘菌素多粘菌素B（硫酸（硫酸盐））79200iu/L（抑制大（抑制大肠肺克，百日咳等）肺克，百日咳等）万古霉素（万古霉素（盐酸酸盐）） 0.001g/L（金葡，化（金葡，化脓性性链球菌，白喉，肺球菌，白喉，肺链，炭疽等），炭疽等）放放线菌菌酮0.08g/L（（杀真菌，致畸，）那他霉素也可代替之真菌，致畸，）那他霉素也可代替之32武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科抗生素的配制抗生素的配制•多粘菌素多粘菌素B：：200mg加入加入100ＭＬ蒸ＭＬ蒸馏水中，混匀后，０水中，混匀后，０.４５４５uM滤器器过滤除菌，以除菌，以5.5ＭＬＭＬ量分装到无菌瓶内，冷量分装到无菌瓶内，冷冻保存。

用保存用时在室温下孵化在室温下孵化•万古霉素：万古霉素：20mg加入加入20ＭＬ蒸ＭＬ蒸馏水中，混匀后０水中，混匀后０.４５４５uM滤器器过滤除菌，以１除菌，以１ML量分装到量分装到无菌瓶内，冷无菌瓶内，冷冻保存用时在室温下孵化在室温下孵化•放放线菌菌酮：：2g加入加入100ＭＬ蒸ＭＬ蒸馏水中，混匀后，０水中，混匀后，０.４５４５uM滤器器过滤除菌，以除菌，以4 ML量分装到量分装到无菌瓶内，冷无菌瓶内，冷冻保存用时在室温下孵化在室温下孵化•注意：放注意：放线菌菌酮具有肝毒性，当具有肝毒性，当处理理这种粉末状种粉末状试剂时，，应该带手套和防手套和防尘口罩33武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科GVPC培养基的制培养基的制备 按上述按上述BCYE培养基的方法配制完成后，冷却至培养基的方法配制完成后，冷却至50 °C时，分，分别添加已配制好添加已配制好的三种抗生素每种取一份的三种抗生素每种取一份剂量，充分混匀后即量，充分混匀后即为最最终选择性培养基性培养基34武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科BCYE-CysBCYE-Cys培养基培养基 为不含为不含L-L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。

按照配制半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基按照配制BCYEBCYE－－αα培养基的方法配培养基的方法配制，不加制，不加L-L-半胱氨酸半胱氨酸35武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科半成品培养基半成品培养基36武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科培养基的培养基的质控控•注意：消毒注意：消毒过程中，加程中，加热时间过长或温度或温度过高，都能影响培养基的高，都能影响培养基的营养养质量培养基成分每批培养基成分每批间的差的差别（特（特别是是α‐ ‐酮戊二酸）也能影响其效能所以，戊二酸）也能影响其效能所以，检验各批次新配制的培养基是十分必要的孵育三天，各批次新配制的培养基是十分必要的孵育三天，观察其支持察其支持军团菌的能力来菌的能力来判断•选择新新鲜培养的培养的LP1型参考菌株和分离到的型参考菌株和分离到的LP1菌株（勿超菌株（勿超过10代）制成菌代）制成菌悬液，液，分分别接种到新旧两个批次的培养基上孵育之后接种到新旧两个批次的培养基上孵育之后记录和比和比较结果，确保其菌落果，确保其菌落形形态和菌落数量是相同的和菌落数量是相同的。

37武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科水样的正压膜过滤法水样的正压膜过滤法1.1.安放滤膜；安放滤膜；2.2.过滤；过滤；3.3.取膜；取膜；4.4.洗膜38武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科水样浓缩物的贮存水样浓缩物的贮存1.1.最好对样品立刻进行分析；最好对样品立刻进行分析；2.2.标本于（标本于（6±26±2））℃℃储藏最多不超过储藏最多不超过1515天 对于军团菌来说，如果储藏于对于军团菌来说，如果储藏于0 0～～6℃6℃，这种损失是最明显的而且，温度在，这种损失是最明显的而且，温度在2020或或20℃20℃以上时，异养生物的生长速度就会变快以上时，异养生物的生长速度就会变快 39武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科两种两种处理方法理方法Ø热处理：理：将将浓缩好的好的样品混匀后分品混匀后分别取取1ml 于无菌管中，放到于无菌管中，放到50度水浴内保温度水浴内保温30分分钟；；Ø酸酸处理理: 取适量取适量浓缩好的好的样品混匀后离心，品混匀后离心，6000rpm10分分钟。

灭菌管吸去上清，菌管吸去上清，至原来一半的量再次重至原来一半的量再次重悬混匀，加入酸混匀，加入酸缓冲液至原来的量，并冲液至原来的量，并轻轻混匀，室混匀，室温下静置温下静置5分分钟，，备用40武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科选择培养基的接种选择培养基的接种Ø将将100ul浓缩好的但未好的但未经任何任何处理的理的标本接种到本接种到GVPC平板上，用无菌接种平板上，用无菌接种环将液体均匀将液体均匀涂布在整个培养基表面涂布在整个培养基表面Ø用同用同样的方法，从水浴中取出的方法，从水浴中取出热处理的理的标本，吸取本，吸取100ul接种到接种到GVPC平板上Ø同同样，，经酸酸处理的立即接种理的立即接种41武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科接种标本培养接种标本培养u接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（36±136±1））℃℃培养培养7-7-1010天u为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子在每次观察为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子。

在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）u在含在含2.5-5.0% CO22.5-5.0% CO2的环境下培养有利于军团菌的生长的环境下培养有利于军团菌的生长42武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科平板的检查平板的检查•培养培养时间内，内，48小小时后，每天后，每天观察菌落生察菌落生长情况•军团菌菌落通常呈灰白，灰菌菌落通常呈灰白，灰绿，紫色和，紫色和蓝色表面光滑，色表面光滑，边缘整整齐一种的菌落（博一种的菌落（博杰曼杰曼军团菌，高曼，杜莫夫等）能自菌，高曼，杜莫夫等）能自动发出白色耀眼的出白色耀眼的荧光43武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科孵育不同孵育不同时间菌落生菌落生长情况情况44武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌菌落特点（军团菌菌落特点（1 1））u军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色u一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。

一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观u在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光45武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌菌落特点（军团菌菌落特点（2 2））u嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅黄色u为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定时间不能超过规定时间u值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别有的特征可能会和上述特征有所区别 46武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科可疑军团菌菌落的进一步鉴定可疑军团菌菌落的进一步鉴定1.1.BCYEBCYE或其他培养基上传代培养或其他培养基上传代培养2.2.革兰染色镜检革兰染色镜检3.3.生化鉴定生化鉴定4.4.PCRPCR检测军团菌特异性基因片段检测军团菌特异性基因片段5.5.免疫荧光的方法确定军团菌的种类免疫荧光的方法确定军团菌的种类 47武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科BCYEBCYE或其他培养基上传代培养（或其他培养基上传代培养（1 1））1.1.至少从每块至少从每块GVPCGVPC平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在BCYEBCYE和和BCYE-CysBCYE-Cys培养基上培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。

传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行2.2.在（在（36±136±1））℃℃至少培养两天至少培养两天3.3.凡是在凡是在BCYEBCYE培养基上生长而在培养基上生长而在BCYE-CysBCYE-Cys培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌 48武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科BCYEBCYE或其他培养基上传代培养（或其他培养基上传代培养（2 2））u营养琼脂或血琼脂培养基可以代替营养琼脂或血琼脂培养基可以代替BCYE-CysBCYE-Cys培养基如果在这三种培养基上都培养基如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养u橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要L-L-半胱氨酸和铁离子，但半胱氨酸和铁离子，但随后在随后在L-L-半胱氨酸缺失时生长微弱半胱氨酸缺失时生长微弱49武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科BCYEBCYE培养基上传代培养培养基上传代培养BCYE 血平板BCYE不含半胱氨酸50武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科革兰染色镜检革兰染色镜检军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.3～0.5μm，长约1.2～5μm或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。

短杆状长丝状武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌生化鉴定军团菌生化鉴定生化试验结果触酶－/弱+氧化酶-/+硝酸盐还原-尿素酶-明胶液化+水解马尿酸+淀粉水解弱+52武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科确定军团菌的种型确定军团菌的种型 Oxoid Oxoid 的乳胶试剂盒可以鉴定出：的乳胶试剂盒可以鉴定出： 嗜肺军团菌血清嗜肺军团菌血清1 1型型; ; 嗜肺军团菌血清嗜肺军团菌血清2-142-14混合型；混合型； L. longbeachae1L. longbeachae1和和2 2型型 ，，L. bozemanii1L. bozemanii1和和2 2型，型，L. L. dumoffii dumoffii，，L. gormaniiL. gormanii，，L. jordanisL. jordanis，，L. micdadeiL. micdadei，， L. anisaL. anisa混合型 53武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科确定军团菌的种型确定军团菌的种型-11.1.在进行鉴定试验前，要保证在在进行鉴定试验前，要保证在BCYEBCYE培养基上生长的菌落是经过形态学检查的纯菌。

培养基上生长的菌落是经过形态学检查的纯菌2.2.属的鉴定，属的鉴定，16sRNA16sRNA54武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科嗜肺军团菌的确定嗜肺军团菌的确定 应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌有条件的可做嗜肺军团菌特异的应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌有条件的可做嗜肺军团菌特异的PCRPCR检测Ø生化培养：氧化酶（－生化培养：氧化酶（－/ /弱弱+ +），硝酸盐还原－，尿素酶－，明胶液化＋，水解），硝酸盐还原－，尿素酶－，明胶液化＋，水解马尿酸马尿酸, ,淀粉酶水解弱淀粉酶水解弱+ +Ø血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型ØPCRPCR：：mip,dnaJ mip,dnaJ 55武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科军团菌血清鉴定军团菌血清鉴定日本生研所Lp1-6,Lb,Lg,Lm,Ll56武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科结果表述结果表述1.1.为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（CFU/mlCFU/ml），从三块），从三块GVPCGVPC平板培养基中挑平板培养基中挑选出已确定军团菌生长最多的平板。

根据浓缩倍数推算出原始水样中的细菌数选出已确定军团菌生长最多的平板根据浓缩倍数推算出原始水样中的细菌数2.2.计算三个计算三个GVPCGVPC平板培养基上菌落生长的平均数是不适宜的，因为这是不能累加的平板培养基上菌落生长的平均数是不适宜的，因为这是不能累加的57武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科检验报告检验报告实验报告应包括以下信息实验报告应包括以下信息1.国际标准的参考国际标准的参考2.鉴定该标本的全部必需的细节，包括采样部位、采样时的操作、样品性质、水系统或植鉴定该标本的全部必需的细节，包括采样部位、采样时的操作、样品性质、水系统或植物的种类、采样点的类别物的种类、采样点的类别3.被检测标本的体积和数量被检测标本的体积和数量4.采样日期采样日期Ø样品收集日期样品收集日期Ø实验室接收日期实验室接收日期Ø实验室检测日期实验室检测日期5.分析过程中所观察到的任何情况都可能影响最后的结果分析过程中所观察到的任何情况都可能影响最后的结果58武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科菌株保存菌株保存Ø短期保存短期保存 将军团菌接种在将军团菌接种在BCYEBCYE斜面培养基上，可以在斜面培养基上，可以在4℃4℃保存数周。

保存数周Ø长期保存长期保存 如要长期保存军团菌，最好用冻干保存法或低温冷冻保存法而冻干保存法因为在如要长期保存军团菌，最好用冻干保存法或低温冷冻保存法而冻干保存法因为在4 ℃ 4 ℃ 或或 –20 ℃20 ℃存时间更长，且运输过程中不受影响，因此是最好的保存方法存时间更长，且运输过程中不受影响，因此是最好的保存方法59武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科低温冷冻保存法低温冷冻保存法1 1、将军团菌接种在、将军团菌接种在BCYEBCYE平板上，平板上， 36±1℃36±1℃，，2.5%-5% CO2.5%-5% CO2 2培养箱或烛缸中培养，确培养箱或烛缸中培养，确定没有污染定没有污染2 2、将已灭菌的含有、将已灭菌的含有ACESACES、、L-L-半胱氨酸和半胱氨酸和15%-20%15%-20%甘油的保存液分装至甘油的保存液分装至2ml2ml的螺帽冻存的螺帽冻存管中，每管管中，每管1ml1ml3 3、用灭菌棉签从、用灭菌棉签从BCYEBCYE平板上刮取适量细菌放入以上装有保存液的冻存管中注意，平板上刮取适量细菌放入以上装有保存液的冻存管中。

注意，使用的冻存管必须能耐受低温使用的冻存管必须能耐受低温4 4、将冻存管放入、将冻存管放入-70 ℃-70 ℃冰箱保存也可以放于冰箱保存也可以放于-20℃-20℃冰箱，但是菌株存活率可能受冰箱，但是菌株存活率可能受影响60武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心————微生物检验科微生物检验科谢 谢 ！61。