带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达.doc

1带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达【摘要】目的:构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的可调控腺病毒载体, 并在 SW620 结肠癌细胞株中观察其调控表达. 方法：将萤火虫荧光素酶 luc 基因和启动子，以及 RU486 调控系统构建成单一的穿梭载体 PDC RULUC，将其与 Admax 腺病毒包装系统的辅助质粒共转染 293 细胞后，构建出可调控的重组腺病毒载体.扩增后用最终稀释法测定了其滴度，并在 SW620 细胞中检测了其基因调控效果.结果：成功地构建了携带有 RU486 调控系统的可调控腺病毒载体Ad RULUC，病毒滴度达到 5.2×1013pfu/L.当给予诱导剂 RU486后，腺病毒载体可以诱导表达荧光素酶，并在一定范围内两者呈正比，而没有 RU486 时，几乎没有报告基因的表达. 结论:腺病毒Ad RULUC 能调控外源基因的表达，为基因调控研究和基因治疗提供了良好的工具. 【关键词】腺病毒载体基因调控末非司酮荧光素酶 0 引言 利用腺病毒载体转移外源基因是基因治疗和基因功能研究中常用的方法.随着腺病毒载体系统研究的深入，尤其是空壳载体的成功应用，外源性基因表达的效率和时间有了明显的提高［1］.然而，2基因的过度表达或不适当的表达不仅影响到对其功能的研究，而且在基因治疗中也可能会对机体产生致命的副作用，因此实现对目的基因的表达时间和表达水平的精确调控是非常重要的，也是目前载体系统的难点之一.通过诱导调控系统来实现基因的精确表达是最常用的方法，在已构建成的多种诱导调控系统中，RU486 诱导调控系统具有诸多优点，是目前功能相对完善的基因调控系统，其应用日益广泛［2］ ，为此，我们将 RU486 诱导调控系统与腺病毒载体相结合，成功构建了 RU486 诱导调控的腺病毒载体，并用荧光素酶报告基因，在体外验证了其对基因表达的调控作用，在国内少见类似报道. 1 材料和方法 1.1 材料 SW620 结肠癌细胞株购自中科院上海细胞所；腺病毒骨架质粒 pBHGloxΔE1,E3cre 和 HEK293 细胞株购自加拿大MicrobixBiosystems 公司；pDC313 穿梭载体；含有启动子和绝缘子的 pB Ins hCMV 质粒均为东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室保存；萤火虫荧光素酶质粒 pGL3 Basic 购自 Promega 公司；含有 GLP65 反式作用调控因子和 GAL4 杂合启动子两个组件的质粒pRS 由西班牙 Navarra 大学医学院钱程教授惠赠.各种限制性内切酶购自 NewEnglandBiolab 公司；诱导剂 RU486 购自 SIGMA 公司；DNA 连接试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；新生小牛血清购自Gibco 公司；LuciferaseReporterAssay 购自 Promega 公司；真核细胞转染试剂 lipofectamine2000 购自 Invetrogen 公司；胎牛3血清、小牛血清购于 GibcoBRL 公司，胶回收试剂盒、PCR 产物回收试剂盒、病毒 DNA 提取试剂盒均购于 QIAGEN 公司.LB 9506型 Luminometer(Berthold 公司) ；PCR 仪(德国 BIOMETRA 公司) ；Napc05420 二氧化碳孵箱(法国 JOAVN 公司)；6 孔板( 丹麦NUNC 公司).PCR 引物设计采用 OLIGO 分析软件在计算机上进行,正义引物和反义引物的 5′端均设计有酶切位点,且其外侧设有保护性碱基. 萤火虫荧光素酶（LUC）基因鉴定引物序列如下：正义引物5′ CGCATGCCAGAGATCCTATTT 3′，反义引物5′ CGGGAGCCACCTGATAGC 3′，引物由 Invetrogen 公司合成. 1.2 方法 1.2.1 穿梭质粒构建与鉴定利用分子生物学技术，将萤火虫荧光素酶 luc 基因和启动子，以及 RU486 调控系统构建成单一的质粒载体 PDC－RULUC，为减少两个转录单元之间的潜在干扰，加入了1600bp 的绝缘子.载体构建流程如下：①pB Ins luc 用 NheI 和KpnI 切下的 Ins luc 片段,插入 pRS 17 质粒的 NheI 和 KpnI 位点,重组质粒命名为 pRS RULUC.②NotⅠ 单酶切下 pRS RULUC 中的调控表达框和 LUC 基因表达框部分装入 pDC312 载体的 NotⅠ位点中，构建成穿梭质粒 pDC RULUC.通过 PCR 和限制性内切酶及测序，筛选阳性重组子. 1.2.2 重组腺病毒的制备与鉴定重组腺病毒载体 Ad RULUC的构建采用 AdMax 腺病毒载体包装系统. 将穿梭质粒 pDC RULUC与以 Ad5 血清型 E1/E3 缺陷型腺病毒骨架质粒4pBHGloxΔE1,E3cre，通过 lipofectamine2000 试剂共转染至 293细胞，通过 Cre/loxP 重组酶介导下的位点特异性重组，使共转染到293 细胞中的穿梭质粒和骨架质粒在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组病毒是 E1/E3 缺失的复制缺陷型腺病毒 .操作方法如下：在 6 孔培养板中每孔接种 3×105 个 HEK293 细胞，将带目的基因的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒各 2μg，用lipofectamine2000 试剂 20μL 共转染 HEK293 细胞，隔 2～3d 换液 1 次，约 7～10d 细胞出现病变，在显微镜下可见细胞变圆、脱落，这表明质粒在 HEK293 细胞中发生了同源重组.经过 3 次病毒空斑纯化，即得到携带 LUC 基因的可调控重组腺病毒.得到的重组载体用 LUC 基因的引物行 PCR 鉴定，以 PGL3 lucbasic 作阳性对照，并设空白阴性对照. 1.2.3 重组腺病毒载体的扩增纯化及滴度测定（TCID50 法）重复感染 293 细胞，进行少量扩增，待全部细胞出现明显的CPE（48h 后） ，收集上清及沉淀混合液，于-80℃～37℃反复冻融3 次，破碎细胞，离心，取病毒上清再次感染 293 细胞，进行大量扩增，48h 后收集沉淀，加入 AdBuffer,以 CsCl 密度梯度超速离心法纯化病毒 2 次.病毒滴度的检测以 293 细胞为靶细胞（ 1×108/L）,病毒液从 1×10-4 开始到 1×10-11，行 10 倍连续稀释后分别感染293 细胞，每一稀释度设 10 个复孔，阴性对照孔加含血清 20mL/L的 DMEM 培养液 2mL，10d 后观察细胞病理反应（CPE） ，仅有小块或一些细胞出现 CPE，该孔计数为阳性. 病毒的稀释度以最低稀释5度能感染所有 293 细胞、最高稀释度完全不能感染 293 细胞为宜.根据 TCID50 法计算公式，算出病毒的滴度. 1.2.4 重组可调控腺病毒载体的表达用携带萤火虫荧光素酶报告基因可调控重组腺病毒感染结肠癌细胞株 SW620，予不同浓度的RU486 诱导表达.操作步骤：将生长状态良好的 SW620 细胞以2×105 个细胞/孔接种于 6 孔板中，待细胞完全贴壁生长至60％～80 ％融合时，予重组可调控腺病毒以 MOI=100 感染细胞后继续培养细胞 24h，分成七个处理组，各组加入一定量的 RU486，使培养液的药物浓度分别达到 0，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9 ，1×10-10mol/L ，每组均设复孔 .继续孵育48h 后行荧光索酶检测，而复孔组实验细胞则予更换新的RPMI1640 培养液后继续孵育 48h 后检测荧光索酶活性. 1.2.5 荧光素酶表达的检测采用荧光素酶报告基因检测试剂盒测定报告基因的表达水平.实验步骤简述如下：弃去 6 孔细胞培养板中的培养液，用 PBS 洗涤细胞 2 次，向每一孔中加入 500μL 的PassiveLysisBuffer(PLB)，在室温轻轻震荡 15min 后，收集细胞裂解液. 取 20μL 的细胞裂解液至荧光测定管中，加入 100μL 萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀后用 Luminometer 荧光计量仪测定萤火虫荧光素酶的活性，每一裂解样品经 3 次检测后取其平均值，计算萤火虫荧光素酶的表达值.具体操作步骤参见 Promega 公司的LuciferaseAssaySystem 检测试剂盒说明书. 统计学处理: 所有数据用 x±s 表示，SPSS10.0 软件包处理实6验数据，组间比较用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1 穿梭质粒 PDC RULUC 的酶切鉴定构建的穿梭质粒PDC RULUC 予 BglⅡ酶切，可得 3697，3440，2824，1161 bp 4 个片段，其中 3697，3440 bp 2 个片段重合，KpnⅠ酶切可得7545、3577 bp 片段， SpeⅠ酶切，可得 11 122 bp 片段(图 1)，实验结果与设计相符，证明载体构建正确.1:Bgl Ⅱ酶切； 2:KpnⅠ 酶切； 3： Marker; 4:SpeⅠ酶切.图 1 重组载体 PDC RULUC 酶切鉴定（略）2.2 质粒测序鉴定对重组质粒的主要元件，包括 GLP65 反式作用调控因子(Regulator)和 GAL4 杂合启动子 (GalE1b)，萤火虫荧光素酶基因（LUC） ，绝缘子（INS）,hCMV 启动子，均送Invetrogen 公司完成测序，结果证实与 GenBank 报道完全符合.2.3 重组腺病毒载体 PCR 鉴定用萤火虫荧光素酶（ LUC）基因引物扩增鉴定包装成功的重组腺病毒载体，扩增后可得 416 bp的特异性条带，与阳性对照一致，阴性对照无特异性条带，正确的可调控重组腺病毒载体命名为 Ad RULUC(图 2).2.4Ad RULUC 重组腺病毒载体的滴度经鉴定的Ad RULUC 重组腺病毒载体在 293 细胞中扩增，用收集的病毒上清重复感染 293 细胞，可使病毒滴度升高，可调控腺病毒载体7Ad RULUC，病毒滴度达到 5.2×1013pfu/L.2.5Ad RULUC 重组腺病毒报告基因的表达可调控重组腺病毒载体 Ad RULUC 经 RU486 诱导后的各组萤火虫荧光素酶的表达值的测定结果显示(图 3), 没有加入诱导剂 RU486 时，重组腺病毒载体 Ad RULUC 有少量的本底表达 . 加入 RU486 时萤火虫荧光素酶的活性在一定范围内随诱导剂的浓度增加而升高，当 RU486 浓度达到 1×10-6mol/L 时，重组腺病毒载体的表达效能达到最大，萤火虫荧光素酶的活性是其基础表达的 40 余倍，此时继续增加RU486 浓度而萤火虫荧光素酶的活性值不再升高. 经方差分析显示RU486 诱导后荧光素酶基因的表达与阴性对照组的差异具有统计学意义(P<0.01). 复孔组实验细胞检测的结果显示，各组的相对荧光素活性与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)，表明去除诱导剂后，调控系统关闭，荧光素酶基因的表达终止.1：阳性对照； 2：marker; 3：阴性对照； 4：PCR 扩增鉴定 marker.图 2 重组腺病毒载体 Ad Ruluc PRC 扩增鉴定（略）图 3RU486 诱导重组腺病毒载体 Ad RULUC 的表达（略）3 讨论病毒载体介导的基因转移方法在目前的基因功能研究和基因治疗中占有重要地位. 由于腺病毒载体具有感染效率高、安全性好、理化性质较稳定、外源基因的容纳量大等多种优点，因此，腺病毒载体系统是目前基因治疗中运用最广的病毒载体之一. 然而单纯利8用腺病毒载体无法实现对目的基因的有效调控，基因的过度表达或不适当的表达不仅会影响基因表达的研究结果，而且对疾病治疗不利，甚至会对机体产生病理性损害，实现对基因表达的精确调控一直是载体系统的最大难题之一.目前控制外源基因的表达有多种方式，而其中最有效的方式就是在转录水平的调控［3］. 早期。