第一章酶学与酶工程.ppt

第一章第一章 酶学与酶工程酶学与酶工程 第一节第一节 酶工程概述酶工程概述1 1、酶学发展历史、酶学发展历史  新陈代谢是生命活动的基础新陈代谢是生命活动的基础, ,是生命活动是生命活动最重要的特征最重要的特征 约公元前约公元前2121世纪世纪夏禹时代夏禹时代, ,人们就会人们就会酿酒 公元前公元前1212世纪世纪周代周代已能制作已能制作饴糖饴糖和用豆类做和用豆类做酱 1810年年Jaseph Gaylussac发现酵母可将糖转发现酵母可将糖转化为酒精化为酒精 1833年年Payen和和Persoz从麦芽得到淀粉酶制从麦芽得到淀粉酶制剂剂(diastase),其意思是其意思是“分离分离” 首先首先发现了酶发现了酶1878年年,Kuhne才给酶一个统一的名词才给酶一个统一的名词,叫叫Enzyme, 希腊文意思是希腊文意思是“在酵母中在酵母中” 19031903年，年，HerlriHerlri提出了酶与底物作用的中提出了酶与底物作用的中间复合物学说间复合物学说 19131913年年MichaelisMichaelis和和MenternMentern导出了米氏方导出了米氏方程程, ,酶由定性到定量酶由定性到定量, , 奠定了酶学发展的奠定了酶学发展的里程碑里程碑 。

19261926年美国科学家年美国科学家SumnerSumner从刀豆提取出了从刀豆提取出了脲酶并获得结晶脲酶并获得结晶, ,证明脲酶具有蛋白质性证明脲酶具有蛋白质性质质 奠定了现代酶学、蛋白质化学的基础奠定了现代酶学、蛋白质化学的基础萨姆纳萨姆纳,J.B. 美国生物化学家美国生物化学家 1946年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 19581958年，年，KoshlandKoshland提出了提出了““诱导契合诱导契合””理论，理论，以解释酶的催化理论和专一性以解释酶的催化理论和专一性1965年年Phillips首次用首次用X射线晶体衍射技术射线晶体衍射技术阐明了鸡蛋清溶菌酶的三维结构阐明了鸡蛋清溶菌酶的三维结构80年代初年代初Cech和和Altman分别发现了分别发现了核酶核酶(ribozyme), 开辟了酶学研究的新领域开辟了酶学研究的新领域, 1989年共同获得诺贝尔化学奖年共同获得诺贝尔化学奖    切赫切赫T.R.CechT.R.Cech（（19471947－）－）     奥尔特曼奥尔特曼S.Altman(1939-) 1986年年Schultz与与Lerner等人研制成功等人研制成功抗体抗体酶酶(abzyme),这一研究成果对酶学研究具这一研究成果对酶学研究具有重要的理论意义和广泛的应用前景。

有重要的理论意义和广泛的应用前景  它集生物学、免疫学、化学于一身，采用它集生物学、免疫学、化学于一身，采用单克隆、多克隆、基因工程、蛋白质工单克隆、多克隆、基因工程、蛋白质工程等高新技术，开创了程等高新技术，开创了催化剂研究和生催化剂研究和生产的崭新领域产的崭新领域Boyer和和walker阐明了阐明了ATP合酶合酶(ATP synthase)合成与分解合成与分解ATP的分子机制的分子机制,于于1997年获得诺贝尔化学奖年获得诺贝尔化学奖ATP合酶的结构（引自合酶的结构（引自Lodish等等1999））现已鉴定出现已鉴定出40004000多种酶多种酶, ,数百种酶已得到结数百种酶已得到结晶这些问题的提出和解决，都与酶学知识和理这些问题的提出和解决，都与酶学知识和理论的掌握有直接的关系论的掌握有直接的关系 2 2、酶工程简介、酶工程简介 （1）酶工程的产生 （2）酶工程的历史 (3) 酶工程研究内容 （（1 1）酶工程的产生）酶工程的产生  生物工程学生物工程学( (biotechnology)biotechnology)也叫生物技术或也叫生物技术或生物工艺学生物工艺学, ,是是2020世纪世纪7070年代初在分子生物学和年代初在分子生物学和细胞生物学基础上发展起来的一个新兴技术领域。

细胞生物学基础上发展起来的一个新兴技术领域 酶工程酶工程( (enzyme engineering)enzyme engineering)是生物工程的是生物工程的主要内容之一主要内容之一 是酶学和工程学相互渗透结合、发展而成的是酶学和工程学相互渗透结合、发展而成的一门新的技术科学一门新的技术科学 是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术机结合而产生的边缘科学技术（（2 2）酶工程的历史）酶工程的历史18941894年，日本科学家首次从米曲霉中提炼出淀粉酶，年，日本科学家首次从米曲霉中提炼出淀粉酶，治疗消化不良，开创人类有目的地生产和应用酶治疗消化不良，开创人类有目的地生产和应用酶制剂的先例制剂的先例19081908年年, ,德国科学家罗门等利用胰酶德国科学家罗门等利用胰酶 ( (胰蛋白酶、胰胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物淀粉酶和胰脂肪酶的混合物) )，用于皮革的鞣制用于皮革的鞣制19171917年年, ,法国人用枯草杆菌产生的淀粉酶作纺织工业法国人用枯草杆菌产生的淀粉酶作纺织工业上的退浆剂。

上的退浆剂19491949年年, ,日本采用深层培养法生产日本采用深层培养法生产α-α-淀粉酶获得成淀粉酶获得成功功, ,使酶制剂生产应用进入工业化阶段使酶制剂生产应用进入工业化阶段 19591959年年, , 葡萄糖淀粉酶催化淀粉生产葡萄糖新工艺葡萄糖淀粉酶催化淀粉生产葡萄糖新工艺研究成功研究成功, , 大大地促进了酶在工业上应用的前景大大地促进了酶在工业上应用的前景 19531953年年，德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树，德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶等与这种载体结脂重氮化，然后将淀粉酶等与这种载体结合，制成了固定化淀粉酶合，制成了固定化淀粉酶 19711971年年，第一次国际酶工程学术会议在美国，第一次国际酶工程学术会议在美国召开，会议的主题就是固定化酶的研制和召开，会议的主题就是固定化酶的研制和应用  20 20世纪世纪7070年代大规模开展了年代大规模开展了固定化细胞、辅固定化细胞、辅酶共固定、增殖细胞固定、动植物细胞固定酶共固定、增殖细胞固定、动植物细胞固定等等研究建立多种类型的酶反应器研究建立多种类型的酶反应器, , 酶工程蓬勃酶工程蓬勃发展。

发展 近近2020年来，年来，酶分子修饰技术、酶的化学合成酶分子修饰技术、酶的化学合成以以及及酶的人工合成酶的人工合成等方面的研究，也在积极地开等方面的研究，也在积极地开展中，从而使酶工程更加显示出展中，从而使酶工程更加显示出广阔而诱人广阔而诱人的的前景 当然酶工程的研究不是孤立的当然酶工程的研究不是孤立的, ,而是与各个而是与各个学科相互关联、相互渗透、相互促进的学科相互关联、相互渗透、相互促进的(3)(3)酶工程的内容酶工程的内容  酶工程主要指酶工程主要指酶制剂酶制剂在工业上的大规模应用在工业上的大规模应用及其相应的研究，由以下部分组成及其相应的研究，由以下部分组成: :①①    酶的生产；酶的生产；②②    酶的分离纯化；酶的分离纯化；③③    酶的固定化；酶的固定化；④④    酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰⑤⑤    酶抑制剂的研究酶抑制剂的研究⑥⑥    生物反应器生物反应器化学酶工程和生物酶工程化学酶工程和生物酶工程  化学酶工程化学酶工程指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用 生物酶工程生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物,主要包括3个方面: ①    用基因工程技术大量生产酶(克隆酶) ②    修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶) ③ 设计新的酶基因合成自然界没有的新酶 全世界著名的酶制剂企业有：全世界著名的酶制剂企业有： 丹麦丹麦NovozymesNovozymes公司、公司、美国美国杰能科国际公司杰能科国际公司（（GenencorGenencor) )。

我国酶制剂工业诞生于我国酶制剂工业诞生于19651965年现有100100多多家生产厂，最大的是无锡酶制剂厂万吨以家生产厂，最大的是无锡酶制剂厂万吨以上企业有上企业有1010家品种有家品种有2020多种，应用在食品、多种，应用在食品、饲料、制革、洗涤剂、纺织、酿造、造纸、饲料、制革、洗涤剂、纺织、酿造、造纸、医药等许多行业医药等许多行业 使用的酶制剂类型使用的酶制剂类型: :一类是水解酶类一类是水解酶类 淀淀粉粉酶酶、、纤纤维维素素酶酶、、蛋蛋白白酶酶、、脂脂肪肪酶酶、、果果胶胶酶酶、、乳乳糖糖酶酶等等, ,占占有有市市场场销销售售额额的的75%75%以上 约约有有60%60%以以上上的的酶酶制制剂剂已已用用基基因因改改良良菌株生产菌株生产, , ＮＯＶＯ公司使用的菌种有ＮＯＶＯ公司使用的菌种有80%80%是基因是基因重组菌株重组菌株 二类是非水解酶二类是非水解酶 主要是分析试剂用酶、医药工业用酶、主要是分析试剂用酶、医药工业用酶、 淀粉加工用酶、乳制品工业淀粉加工用酶、乳制品工业用酶用酶第二节第二节  酶的分类、组成、结构特酶的分类、组成、结构特          点和作用机制点和作用机制       一、酶的分类一、酶的分类（一）酶的命名法（一）酶的命名法1 1、习惯命名法、习惯命名法(1) 依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶；依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶；(2) 依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶；依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶；(3) 结合底物和催化反应的性质命名：琥珀酸脱氢酶；结合底物和催化反应的性质命名：琥珀酸脱氢酶；(4) 有时加上酶的来源：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶。

有时加上酶的来源：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶（二）国际系统命名（二）国际系统命名Ø基基本本原原则则：：明明确确标标明明酶酶的的底底物物及及催催化化反反应应的的性性质质（（底底物物为为水时可略去不写）水时可略去不写）Ø举例：举例：   谷谷丙丙转转氨氨酶酶的的系系统统名名称称：：丙丙氨氨酸酸: -酮酮戊戊二酸二酸 氨基转移酶氨基转移酶 丙氨酸：丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶（三）国际系统分类法及编号（（三）国际系统分类法及编号（EC编号）编号）（（1））按按反反应应性性质质分分六六大大类类，，用用1、、2、、3、、4、、5、、6表示表示：：氧、转、水、裂、异、合；氧、转、水、裂、异、合；Ø1：氧化还原酶：氧化还原酶  2：转移酶：转移酶            3：水解酶：水解酶 Ø4：：裂裂合合酶酶         5：：异异构构酶酶             6：：合合成成酶酶 (连连接接酶酶)（（2））根根据据底底物物中中被被作作用用的的基基团团或或键键的的特特点点，，将将每每一一大大类类分分为为若若干干个个亚亚类类，，编编号号用用1、、2、、3等；等；（（3））每每个个亚亚类类又又可可分分为为若若干干个个亚亚一一亚亚类类，，用编号用编号1、、2、、3表示。

表示乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶     EC1.1.1.1 ，，第一个数字表示大类：第一个数字表示大类：    氧化还原酶类氧化还原酶类第二个数字表示反应基团：醇基第二个数字表示反应基团：醇基第三个数字表示电子受体：第三个数字表示电子受体：NAD+第四个数字表示此酶底物：乙醇第四个数字表示此酶底物：乙醇前前面面三三个个编编号号表表明明这这个个酶酶的的特特性性：：反反应应性性质质、、底底物物性性质质（（键键的的类类型型））及及电电子子或或基基团团的的受受体体，，第第四四个个编编号号用用于区分不同的底物于区分不同的底物 ØØ酶酶酶酶的的的的编编编编号号号号由由由由4 4个个个个数数数数字字字字组组组组成成成成，，，，中中中中间间间间以以以以“ “·”·”隔隔隔隔开开开开第第第第一一一一个个个个数数数数字字字字表表表表示示示示大大大大类类类类，，，，第第第第二二二二个个个个数数数数字字字字表表表表示示示示亚亚亚亚类类类类，，，，第第第第三三三三个个个个表表表表示示示示亚亚亚亚- -亚亚亚亚类类类类，，，，第第第第四四四四个个个个数数数数字字字字表表表表示示示示在在在在亚亚亚亚- -亚亚亚亚类中的编号。

类中的编号类中的编号类中的编号二、酶的组成和结构特点二、酶的组成和结构特点 （一）酶的化学本质（一）酶的化学本质 酶除了酶除了少数少数有催化活性的有催化活性的RNARNA分子外分子外, ,几乎所有的酶都是几乎所有的酶都是蛋白质蛋白质具有蛋白质具有蛋白质的典型性质同时具有自身的特性的典型性质同时具有自身的特性 （二）（二）  酶的化学组成酶的化学组成Ø单单纯纯酶酶类类(simple enzyme)：：仅仅由由蛋蛋白白质质组组成成，，不不含含其其它它物物质质，，如如脲脲酶酶、、溶溶菌菌酶酶、、淀淀粉粉酶酶、、脂脂肪肪酶酶、、核核糖糖核核酸酶等Ø缀缀合合酶酶类类（（conjugated enzyme)：：全全酶酶=脱脱辅辅酶酶+辅辅因因子子，，二二者者存存在在酶酶才才有有催催化化作作用用；；如如超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶（（Cu2＋＋、、Zn2＋＋）、）、乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（NAD+））Ø 辅酶：辅酶：与酶蛋白结合与酶蛋白结合较松较松，可透析除去如，可透析除去如NAD + ，，NADP +Ø 辅辅基基：：共共价价键键，，与与酶酶蛋蛋白白结结合合较较紧紧，，透透析析不不可可除除去去。

如如细细胞胞色色素氧化酶的铁卟啉素氧化酶的铁卟啉Ø 金属离子：金属离子：Fe2+、、 Zn2+、、 Cu+、、Cu2+、、 Mn3+、、Mg2+ 、、K+、、 Na+ 、、Co2+等Ø 有机化合物：有机化合物：NAD + ，，NADP + ，，FAD，，生物素，卟啉等生物素，卟啉等 Ø酶酶的的辅辅因因子子主主要要有有金金属属离离子子和和有有机机化化合合物物，，并并且且根根据据与与脱脱辅辅酶酶结合的松紧程度不同可分为两类，即结合的松紧程度不同可分为两类，即辅酶和辅基辅酶和辅基（一）（一）  单体酶单体酶（二）（二）  寡聚酶寡聚酶（三）（三）  多酶复合体多酶复合体根据酶蛋白分子特点根据酶蛋白分子特点1.  单体酶单体酶Ø一般是由一条肽链组成，大多是催化水解反应的酶一般是由一条肽链组成，大多是催化水解反应的酶  牛胰牛胰RNase          124a.a    单链单链   鸡卵清溶菌酶鸡卵清溶菌酶    129a.a    单链单链   2. 寡聚酶寡聚酶       由由两两个个或或两两个个以以上上亚亚基基组组成成的的酶酶，，亚亚基基可可以以相相同同或或不不同同，，一一般般是是偶偶数数，，亚亚基基间间以以非非共共价价键键结结合合。

亚亚基基一一般般无无活活性性,必必须相互结合才有活性须相互结合才有活性Ø如乳酸脱氢酶等如乳酸脱氢酶等3. 多酶复合体多酶复合体Ø由由几几个个酶酶靠靠非非共共价价键键结结合合而而成成，，其其中中每每一一个个酶酶催催化化一一个个反反应应，，所所有有反反应应依依次次进进行行，，构构成成一个一个代谢途径或代谢途径代谢途径或代谢途径的一部分的一部分Ø大肠杆菌大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：由三种酶组成：①①丙酮酸脱氢酶（丙酮酸脱氢酶（E1））②②二氢硫辛酸转乙酰基酶（二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2））    ③③二氢硫辛酸脱氢酶（二氢硫辛酸脱氢酶（E3））（二）酶的结构特点（二）酶的结构特点1.1.有四级空间结构形式，寡聚酶必须具有有四级空间结构形式，寡聚酶必须具有正确的四级结构才有活性正确的四级结构才有活性2 2、、具有活性的酶都是球蛋白具有活性的酶都是球蛋白, ,即被广泛折即被广泛折叠、结构紧密的多肽链叠、结构紧密的多肽链, ,其氨基酸亲水基其氨基酸亲水基团在外表团在外表, ,而疏水基团向内而疏水基团向内三、酶的作用机制 （一）结合部位（一）结合部位 Binding siteBinding site 酶分子中与酶分子中与底物结合底物结合的部位或区域一般的部位或区域一般称为结合部位。

称为结合部位（二）催化部位（二）催化部位 catalytic sitecatalytic site  酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位酶的活性中心的概念酶的活性中心的概念 通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心ü 结合部位决定酶的专一性，ü 催化部位决定酶所催化反应的性质 Ø酶酶的的活活性性中中心心包包括括底底物物结结合合部部位位（（决决定定酶酶的的专专一一性性））、、催催化化部部位位（（直直接接参参与催化反应，形成产物）与催化反应，形成产物）酶的作用机制酶的作用机制  酶酶结结合合底底物物分分子子, ,形形成成酶酶- -底底物物复复合合物物酶酶活活性性部部位位的的活活性性残残基基与与底底物物分分子子结结合合, , 转转变变为为过过渡渡态态, ,然然后后生生成成产产物物, ,释释放放到到溶溶液液中中游游离离的的酶酶与与另另一一分分子子底底物物结结合合后后, ,开开始它的又一次循环始它的又一次循环一）两种模型（一）两种模型 1 1、、锁锁和和钥钥匙匙模模型型(lock-and-key model)    1894年年Emil Fischer 德国科学家。

师从凯库勒德国科学家师从凯库勒他发现了他发现了苯肼苯肼，对，对糖类、糖类、嘌呤类有机化合物嘌呤类有机化合物的研究的研究取得了突出的成就，因而取得了突出的成就，因而荣获荣获1902年的诺贝尔化学年的诺贝尔化学奖         认为整个酶分子的天然构象是具认为整个酶分子的天然构象是具有有刚性结构刚性结构的，酶表面具有特定的的，酶表面具有特定的形状酶与底物的结合如同一把钥形状酶与底物的结合如同一把钥匙对应一把锁一样匙对应一把锁一样2、、诱导契合模型诱导契合模型(induced-fit model)              1958年由年由Koshland 提出           认为酶表面并没有一种与底物互认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状诱导才形成了互补形状随后的随后的X衍射分析实验结果支持这一假说衍射分析实验结果支持这一假说, 比较比较满意地说明了酶的专一性满意地说明了酶的专一性1)  酶有其原来的形状酶有其原来的形状,不一定一开始就是底物不一定一开始就是底物的模板2)  底物能诱导酶蛋白分子形状发生一定的变底物能诱导酶蛋白分子形状发生一定的变化。

化3)  酶分子发生变化后就能与底物互补楔合酶分子发生变化后就能与底物互补楔合4) 在酶反应过程中在酶反应过程中,活性中心构象的变化是可逆活性中心构象的变化是可逆的的诱导契合学说认为诱导契合学说认为: :               酶的活性部位在结构上酶的活性部位在结构上是柔性的而非刚性是柔性的而非刚性的的也就是说不固定的也就是说不固定的,即具可逆性和弹性即具可逆性和弹性（二）酶的作用机制（二）酶的作用机制1 1、、  酸碱催化酸碱催化Ø酶酶分分子子的的一一些些功功能能基基团团起起瞬瞬时时质质子子供供体体或或质质子子受受体体的的作作用用分为狭义的酸碱催化和广义的酸碱催化分为狭义的酸碱催化和广义的酸碱催化Ø狭义的酸碱催化剂即是狭义的酸碱催化剂即是H+与与OH-  广义的酸碱是指能供给质子广义的酸碱是指能供给质子(H+)与接受质子的物质可作为与接受质子的物质可作为广义酸碱的功能基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基广义酸碱的功能基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基Ø影响酸碱催化反应速度的两个因素：影响酸碱催化反应速度的两个因素：⑴⑴酸酸或或碱碱的的强强度度组组氨氨酸酸咪咪唑唑基基的的解解离离常常数数为为6，，在在pH6附附近近（（中中性性溶溶液液））有有一一半半以以质质子子供供体体（（酸酸））形形式式存存在在，，另另一一半半以以质质子子受受体（碱）形式存在。

体（碱）形式存在⑵⑵给给出出质质子子或或结结合合质质子子的的速速度度其其中中，，咪咪唑唑基基给给出出质质子子和和结结合合质质子子的的速速度度十十分分迅迅速速，，是是酶酶的的催催化化反反应应中中最最有有效效、、最最活活泼泼的的一一个个功能基团功能基团2 2、共价催化、共价催化Ø酶的某些亲核基团，能迅速与底物形成共价中酶的某些亲核基团，能迅速与底物形成共价中间复合物，降低反应的活化能，使反应加速间复合物，降低反应的活化能，使反应加速 Ø酶亲核基团：酶亲核基团：Ser-OH，，Cys-SH，，His-咪唑基等咪唑基等    底物亲电中心：磷酰基底物亲电中心：磷酰基（（-P=O），），酰基（酰基（-C=O），），糖基（糖基（Glc-C-））3 3、邻近效应及定向效应、邻近效应及定向效应 邻近效应邻近效应 底物的反应基团与酶的催化基团越靠底物的反应基团与酶的催化基团越靠近近, ,其反应速度越快其反应速度越快定向效应定向效应 催催化化基基团团与与底底物物的的反反应应基基团团之之间间的的正正确取位，从而提高酶催化反应速度的效应确取位，从而提高酶催化反应速度的效应。

4 4、变形或张力、变形或张力 当特异底物与酶结合时当特异底物与酶结合时, ,酶蛋白发生一定构象酶蛋白发生一定构象变化变化, ,与底物发生诱导契合酶使底物分子中的敏与底物发生诱导契合酶使底物分子中的敏感键发生变形或张力感键发生变形或张力底底物物形形变变，，利利于于形形成成ESES复复合合物物进进一一步步转转换换成成过过渡渡态结构，大大降低活化能态结构，大大降低活化能5 5、酶的活性中心为疏水区域、酶的活性中心为疏水区域  酶酶的的活活性性中中心心常常为为酶酶分分子子的的凹凹穴穴此此处处常常为为非非极极性性或或疏疏水水性性的的氨氨基基酸酸残残基基介介电电常常数数低低, ,并并排排出出极极性性高高的的水水分分子子这这使使得得底底物物分分子子的的反反应应键键和和酶酶的的催催化化基基团团之之间间易易发发生生反反应应, ,有有助于加速酶催化反应助于加速酶催化反应 6 6、多元催化和协同效应、多元催化和协同效应 多个基元催化反应配合在一起共同起作用多个基元催化反应配合在一起共同起作用 上面介绍了实现酶反应高效率的几个上面介绍了实现酶反应高效率的几个因素因素, ,但是并不能指出那一种因素可以影但是并不能指出那一种因素可以影响所有酶的全部催化活性。

更可能的情响所有酶的全部催化活性更可能的情况是况是：：不同的酶不同的酶, ,起主要影响的因素可能起主要影响的因素可能是不同的是不同的, ,各自都有其特点各自都有其特点, ,可以受一种可以受一种或几种因素的影响或几种因素的影响第三节第三节 酶作为催化剂的显著特点酶作为催化剂的显著特点  酶与化学催化剂比较具有显著的特酶与化学催化剂比较具有显著的特性最重要的有三方面性最重要的有三方面: : 一、高催化效率一、高催化效率 二、强专一性二、强专一性 三、酶活性可以调控三、酶活性可以调控 一、高催化效率一、高催化效率  催化能力，酶加快反应速度可高达催化能力，酶加快反应速度可高达108-1020倍 酶酶促促反反应应速速度度相相当当高高,而而酶酶催催化化的的最最适适条条件件几几乎乎都都为为温温和和的的温温度度和和非极端非极端pH以以NH3为例：为例：固氮酶：固氮酶：25℃、中性、中性pH工业：工业：700~900K、、10~90MPa（一）（一） 酶专一性类型酶专一性类型1、结构专一性、结构专一性（（1）绝对专一性）绝对专一性        酶对底物的要求非常严格，只能对某一种底物的某一酶对底物的要求非常严格，只能对某一种底物的某一种反应起催化作用。

种反应起催化作用        脲酶只能催化尿素水解脲酶只能催化尿素水解, ,而对尿素的各种衍生物或尿而对尿素的各种衍生物或尿素的其它反应不起作用素的其它反应不起作用  （（2））相相对对专专一一性性：：对对底底物物专专一一性性降降低低，，可可作作用用一一类类结结构构相相近近的底物         二、酶的专一性二、酶的专一性★★基团专一性基团专一性l除了对键有要求，还除了对键有要求，还对于键的一端的基团对于键的一端的基团要求严格要求严格l例如：例如：α-D-葡萄糖苷酶不但要求葡萄糖苷酶不但要求α-糖苷键糖苷键,并且要并且要求求α-糖苷键的一端必须有糖苷键的一端必须有葡萄糖残基葡萄糖残基,而对键的另而对键的另一端一端R基团则要求不严基团则要求不严,因此它可催化含有因此它可催化含有α-葡萄葡萄糖苷的蔗糖或麦芽糖水解糖苷的蔗糖或麦芽糖水解,但不能使含有但不能使含有β-葡萄糖葡萄糖苷的纤维二糖水解苷的纤维二糖水解★★键专一性：键专一性：          作用于一定的键作用于一定的键,但对键两端的基团但对键两端的基团并无严格要求这类酶对底物结构的要并无严格要求这类酶对底物结构的要求低      酯酶催化酯酶催化酯键酯键的水解的水解,而对底物而对底物R-C中中的的R及及R’基团都没有严格的要求基团都没有严格的要求,即能催即能催化水解甘油酯类、简单脂类化水解甘油酯类、简单脂类,也能催化丙也能催化丙酰、乙酰胆碱等。

酰、乙酰胆碱等  2. 立体异构专一性立体异构专一性          有些酶不仅对底物化学结构有要求有些酶不仅对底物化学结构有要求,而且对而且对底物分底物分 子的子的立体构型立体构型也有要求也有要求,称作立体异构专称作立体异构专一性立体异一性立体异 构专一性又分两类构专一性又分两类: (1) 旋光异构专一性旋光异构专一性        当底物具有旋光性时当底物具有旋光性时,酶只能作用于其中的一酶只能作用于其中的一种 它是酶反应中相当普遍的现象它是酶反应中相当普遍的现象例如：例如：      L-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶只能只能 催化催化L-氨基酸氧化氨基酸氧化,而对而对D-氨基酸无作用氨基酸无作用(2) 几何（顺反）异构专一性几何（顺反）异构专一性          酶对底物的几何构型有严格的要求称之为酶对底物的几何构型有严格的要求称之为几何异构专一性几何异构专一性   例如：例如：     延胡索酸酶只能催化延胡索酸酶只能催化反丁烯二酸反丁烯二酸（即延胡索酸）（即延胡索酸），而不能催化，而不能催化顺丁烯二酸顺丁烯二酸的水合作用的水合作用三、调节性三、调节性 酶活性的调节控制主要有下列酶活性的调节控制主要有下列7种方式种方式 1. 酶浓度的调节酶浓度的调节   两种方式：诱导或抑制酶的合成；调节酶两种方式：诱导或抑制酶的合成；调节酶的降解的降解      例如：例如：β-半乳糖苷酶的合成。

半乳糖苷酶的合成2. 2. 激素调节激素调节 例：乳糖合成酶例：乳糖合成酶 乳糖合成酶由催化亚基和调节亚基组成，乳糖合成酶由催化亚基和调节亚基组成，可以催化乳糖合成反应：可以催化乳糖合成反应： E EUDP-UDP-半乳糖半乳糖 + + 葡萄糖葡萄糖 乳糖乳糖 + + UDPUDP调节亚基合成是受激素控制的3. 共价修饰调节共价修饰调节  在一种酶分子上在一种酶分子上,共价地引入或去掉一共价地引入或去掉一个基团从而改变酶的活性个基团从而改变酶的活性         例：例：磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化 4.4.限制性蛋白水解作用与酶活力调控限制性蛋白水解作用与酶活力调控 高特异性的共价修饰调节系统高特异性的共价修饰调节系统 例：酶原激活、血液凝固、补体激活例：酶原激活、血液凝固、补体激活5.抑制剂的调节抑制剂的调节 例：胰脏的胰蛋白酶例：胰脏的胰蛋白酶    抑肽酶抑肽酶,    磷酸变位酶磷酸变位酶       2,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸6.6.反馈调节反馈调节 许许多多小小分分子子物物质质的的合合成成是是由由一一连连串串的的反反应应组组成成的的。

催催化化此此物物质质生生成成的的第第一一步步反反应应的的酶酶, ,往往往往可可以以被被它它的的终终端端产产物物所所抑抑制制, ,这这种种对对自自我我合合成的抑制叫反馈抑制成的抑制叫反馈抑制例：异亮氨酸抑制第一个酶一苏氨酸脱氨酶例：异亮氨酸抑制第一个酶一苏氨酸脱氨酶 7.7.金属离子和其他小分子化合物的调节金属离子和其他小分子化合物的调节 第四节第四节  影响酶活性的因素影响酶活性的因素 一、酶速度一、酶速度  酶催化反应的速率通酶催化反应的速率通常称作酶速度常称作酶速度(velocity)酶速度通常以酶促反应的酶速度通常以酶促反应的初速度初速度为准为准( (底物消耗底物消耗≤≤5%5%）） 因为底物浓度因为底物浓度降低、酶部分失活、产物降低、酶部分失活、产物抑制和逆反应等因素，会抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的使反应速度随反应时间的延长而下降延长而下降几个概念酶酶的的活活力力单单位位：：表表示示酶酶活活力力大大小小所所用用的的两两个国际单位个国际单位Ø1IU：：在在最最适适反反应应条条件件下下，，每每分分钟钟催催化化1μmol底底物物转转化为产物所需的酶量，称一个化为产物所需的酶量，称一个IU。

Ø1 Kat：：在在最最适适反反应应条条件件下下，，每每秒秒钟钟催催化化1mol底底物物转化为产物所需的酶量，称转化为产物所需的酶量，称Kat单位单位       1 Kat＝＝60 ×106 IU ；；  1 IU ＝＝1/60μ Kat＝＝16.7n KatØ最最适适条条件件：：最最适适温温度度（（25℃或或37 ℃））,最最适适pH、、最最适缓冲液离子强度、最适底物浓度适缓冲液离子强度、最适底物浓度底底物物浓浓度度要要求求：：（（1））通通常常很很大大，，使使酶酶饱饱和和；；（（2））底底物消耗物消耗≤5%q酶活力酶活力(或总活力或总活力):样品中酶的总单位样品中酶的总单位q比活力比活力:是每毫克蛋白质中酶单位的数量是每毫克蛋白质中酶单位的数量(U/mg)  比活力比活力=活力活力U/mg蛋白蛋白        =总活力总活力U/总蛋白总蛋白mg 影响酶活力的因素影响酶活力的因素1、底物浓度、底物浓度酶速度对底物浓度酶速度对底物浓度([S])的依赖关系的正常模式是的依赖关系的正常模式是 ：：q在低的底物浓度下在低的底物浓度下,[S]增加增加1倍倍,将导致起始速度将导致起始速度(Vo)也增加也增加1倍。

倍q在较高底物浓度下在较高底物浓度下,酶被饱和酶被饱和,进一步增高进一步增高[S],只只导致导致Vo的微小变化的微小变化 q进进一一步步加加入入底底物物对对酶酶速速度度也也将将不不发发生生影影响响Vo对对[S]的的关关系系图图形形称称为为双双曲曲线线(hyperbolic curve )2、酶浓度、酶浓度在在底底物物浓浓度度饱饱和和的的情情况况下下(即即所所有有酶酶分分子子都都与与底底物物结结合合),酶酶浓浓度度的的加加倍倍将将导导致致Vo的的加倍 Vo与酶浓度的关系图为直线图形与酶浓度的关系图为直线图形 3 3、温度的影响、温度的影响q一方面是温度升高一方面是温度升高, ,酶促反应速度加快酶促反应速度加快 另另一一方方面面, ,温温度度升升高高, ,导导致致酶酶活活性性降降低低甚甚至丧失 q大多数酶都有一个最适温度大多数酶都有一个最适温度 在最适温在最适温度条件下度条件下, ,反应速度最大反应速度最大q最适温度不是酶的最适温度不是酶的特征物理常数特征物理常数, ,也不是也不是固定值固定值, ,而与酶作用时间的长短有关生而与酶作用时间的长短有关生物不同生长阶段有不同的最适温度。

物不同生长阶段有不同的最适温度4、pH  每个酶都有最适每个酶都有最适pH,在此在此pH下催化反应的速率下催化反应的速率是它的最高值是它的最高值1）最适）最适pH有时因底物种类、浓度及缓冲液成分有时因底物种类、浓度及缓冲液成分不同而不同不同而不同 （（2）酶的最适）酶的最适pH并不是一个常数并不是一个常数,只是在一定条件只是在一定条件下才有意义下才有意义 pH影响酶活力的原因可能有以下几个方面影响酶活力的原因可能有以下几个方面:     (A) 过酸过酸,过碱会影响酶蛋白的构象过碱会影响酶蛋白的构象,甚至使酶失甚至使酶失活     (B) 影响底物分子的解离影响底物分子的解离    (C) pH影响酶分子的解离影响酶分子的解离,而这些基团的离子化状而这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中心活力中心的构象有态与酶的专一性及酶分子中心活力中心的构象有关第五节 酶动力学和抑制作用一、米一、米-曼氏模式曼氏模式 1、Michaelis-Menten 方程的建立 米氏方程米氏方程 2、米氏常数的意义、米氏常数的意义  Km：：米米氏氏常常数数，，物物理理意意义义为为反反应应速速率率为为最最大大速速率率Vmax一一半半时时底底物物的的浓浓度度，，单单位位与与底底物浓度同物浓度同   （（1））Km是酶的一个特性常数，是酶的一个特性常数，Km大小只与大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。

当底物确定，酶性质有关，而与酶浓度无关当底物确定，反应温度，反应温度，pH及离子强度一定时，及离子强度一定时，Km值为值为常数，可用来鉴别酶常数，可用来鉴别酶  Km一般在一般在1××10-6~10-1mol/L之间之间不同的酶不同的酶Km值不同，测定值不同，测定Km要在相同测定条要在相同测定条件（件（pH、、温度、离子强度）下进行温度、离子强度）下进行（（2））Km值可用于判断酶的专一性和天然产物，值可用于判断酶的专一性和天然产物，若一个酶有几种底物就有几个若一个酶有几种底物就有几个Km值，其中值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物 （（3）可近似表示酶与底物亲和力的大小可近似表示酶与底物亲和力的大小  真正表示酶与底物亲和力为真正表示酶与底物亲和力为Ks=k2 /k1                (注注 Km= k2+k3 / k1)   （（4））已知已知Km可由可由[S]计算计算v，，或由或由v计算计算[S]  二、二、LineweaverLineweaver-Burk-Burk作图作图y=ax+by=ax+b纵轴截距：纵轴截距：1/ 1/ V Vmaxmax；；横轴截距：横轴截距：-1/-1/K Km m；；斜率：斜率：K Km m / / V Vmaxmax。

三、三、 酶的抑制作用酶的抑制作用 抑抑制制作作用用：：酶酶的的必必需需基基团团的的化化学学性性质质改改变变而而引引起起酶酶活活力力降降低低或或丧丧失失，，但但不不引引起起酶酶蛋蛋白白变性凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂性的物质称为酶的抑制剂 意义：研究酶的抑制剂，可以研究酶的结意义：研究酶的抑制剂，可以研究酶的结构与功能、酶催化机制，进行药物、农药构与功能、酶催化机制，进行药物、农药的设计与筛选的设计与筛选 （一）抑制作用的类型：（一）抑制作用的类型： 1. 不可逆抑制作用不可逆抑制作用Irreversible inhibition  2. 可逆性抑制作用可逆性抑制作用Reversible inhibition    1) 竞争性抑制竞争性抑制            Competitive inhibition       2)   非竞争性抑制非竞争性抑制            Non-competitive inhibition  有机磷化合物有机磷化合物羟基酶羟基酶失活的酶失活的酶酸酸1、不可逆抑制作用、不可逆抑制作用 这类抑制剂通常以这类抑制剂通常以共价键共价键与酶蛋白中的基团结合，与酶蛋白中的基团结合，从而使酶活性降低，甚至丧失。

不能用透析、超滤等物理从而使酶活性降低，甚至丧失不能用透析、超滤等物理方法除去这些抑制剂，使酶活性恢复方法除去这些抑制剂，使酶活性恢复举例举例有机磷化合物有机磷化合物   羟基酶羟基酶解毒解毒 -- 解磷定解磷定(PAM)2 2. . 可逆性抑制作用可逆性抑制作用 抑制剂通常以非共价键与酶可逆抑制剂通常以非共价键与酶可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去抑制剂可用透析、超滤等方法除去类型类型 竞争性抑制竞争性抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制 １１））竞争性抑制作用竞争性抑制作用+IEIE + SE + PES反应模式反应模式定义定义抑抑制制剂剂与与底底物物的的结结构构相相似似，，能能与与底底物物竞竞争争酶酶的的活活性性中中心心，，从从而而阻阻碍碍酶酶底底物物复复合合物物的的形形成成，，使使酶酶的的活活性性降降低低这这种种抑抑制制作作用用称称为为竞争性抑制作用竞争性抑制作用  * * 特点特点b)充充分分的的高高底底物物浓浓度度可可以以将将结结合合到到活活性性部部位位的的抑抑制制剂剂分分子子竞竞争争地地排排 出出 ，， 因因 此此 酶酶 的的Vmax不不变变，，但但在在竞竞争争性性抑抑制制剂剂存存在在下下，，酶酶对对其其底底物物的的亲亲和和力力降低，因此降低，因此Km增大。

增大a)I与与S结结构构类类似似，，竞竞争争酶酶的的活活性性中心；中心；交于交于y轴轴2)非竞争性抑制非竞争性抑制     底物和抑制剂同时和酶结合底物和抑制剂同时和酶结合,两者没有两者没有竞争作用竞争作用        酶活力降低酶活力降低             如如Leu是精氨酸酶非竞争性抑制剂是精氨酸酶非竞争性抑制剂         * * 特点特点a) a)抑抑制制剂剂与与酶酶活活性性中中心心外外的的必必需需基基团团结结合合，，底底物物与与抑抑制制剂剂之之间间无无竞竞争关系；争关系；b)b)抑抑制制程程度度取取决决于于抑制剂的浓度；抑制剂的浓度；c) c)非非竞竞争争性性抑抑制制剂剂的的效效应应不不能能由由增增高高底底物物浓浓度度而而克克服服，，所所以以VmaxVmax降降低低，，酶酶对对底底物物的的亲亲和和力力不不变变，，因此因此KmKm不变                            交于交于x x轴轴 第六节第六节 蛋白质、酶和重组蛋白质、酶和重组 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化一、蛋白质纯化的一般考虑 Ø分离纯化用的原料来源要分离纯化用的原料来源要分离纯化用的原料来源要分离纯化用的原料来源要方便方便方便方便, ,成本成本成本成本要低要低要低要低; ;目的蛋目的蛋目的蛋目的蛋白质白质白质白质含量含量含量含量、、、、活性活性活性活性相对要高相对要高相对要高相对要高 Ø条件要尽可能十分条件要尽可能十分条件要尽可能十分条件要尽可能十分温和温和温和温和 Ø审慎地思考审慎地思考审慎地思考审慎地思考, ,避免随意性避免随意性避免随意性避免随意性 Ø建立建立建立建立灵敏灵敏灵敏灵敏、、、、特异特异特异特异、、、、精确精确精确精确的检测手段的检测手段的检测手段的检测手段, ,评估纯化方法评估纯化方法评估纯化方法评估纯化方法 Ø纯化纯化纯化纯化策略策略策略策略的选择的选择的选择的选择 （一）材料的选择（一）材料的选择天然材料：天然材料：早期酶制剂多是从动植物中提取。

早期酶制剂多是从动植物中提取Ø但动植物原料生长周期长、成本高，又受地理、但动植物原料生长周期长、成本高，又受地理、气候和季节等因素影响气候和季节等因素影响基基因因工工程程材材料料：：对对于于天天然然不不易易得得到到的的蛋蛋白白，，目目前前通通过工程菌或工程细胞表达而获得过工程菌或工程细胞表达而获得 工业用酶多采用微生物发酵生产工业用酶多采用微生物发酵生产二、酶的分离和纯化二、酶的分离和纯化微生物发酵微生物发酵 目前工业应用酶大多数来自微生物，目前工业应用酶大多数来自微生物，这是因为以微生物为生产原料有许多优点这是因为以微生物为生产原料有许多优点Ø微生物种类繁多；微生物种类繁多； 产酶微生物多；产酶微生物多；Ø一种微生物可以产多种酶；一种微生物可以产多种酶；Ø微生物繁殖快、生产周期短、培养方便；微生物繁殖快、生产周期短、培养方便；Ø微生物易改造，可通过多种手段进行育种微生物易改造，可通过多种手段进行育种酶的发酵生产酶的发酵生产酶的生产菌酶的生产菌 —— 先决条件，直接影响发酵先决条件，直接影响发酵的生产成本的生产成本对生产菌的要求：对生产菌的要求：Ø 非病源菌，非病源菌，同时在系统发育上与病原菌无同时在系统发育上与病原菌无关，不产毒素及其他生理活性物质关，不产毒素及其他生理活性物质；；Ø 产酶量高，产酶量高，最好分泌胞外酶最好分泌胞外酶；；Ø 生产菌稳定，生产菌稳定，不易变异、退化、不易感染不易变异、退化、不易感染噬菌体噬菌体；；Ø 容易培养，能容易培养，能利用廉价原料，发酵周期短利用廉价原料，发酵周期短。

生产菌的获得生产菌的获得采样采样 — — 分离分离 — — 筛选筛选 — — 诱变；诱变； 采样：在富含该酶作用底物的场采样：在富含该酶作用底物的场 所采样；所采样； 在与酶活性最适条件相的在与酶活性最适条件相的 环境采样；环境采样； 分离：平板划线法、直接稀释法分离：平板划线法、直接稀释法. . 筛选：初筛、复筛；筛选：初筛、复筛；向菌种中心购买或索取向菌种中心购买或索取中国国家级菌种保藏管理中心（中国国家级菌种保藏管理中心（7 7个）个） 名称及成立年份 依 托 单 位 中国农业微生物菌种保藏管理中心 中国农业科学院土壤肥料研 究所 (ACCC)—1980 中国工业微生物菌种保藏管理中心 中国食品发酵工业研究院 (CICC)—1979 中国医学微生物菌种保藏管理中心 中国药品生物制品检定所 (CMCC)—1979 中国兽医微生物菌种保藏管理中心 中国兽医药品检定所 (CVCC)—1979 中国林业微生物菌种保藏管理中心 中国林业科学研究院 (CFCC)—1985 中国抗菌素菌种保藏管理中心 中国医学科学院医药生物技 术研究所(CACC)—1979 中国普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院微生物研究所 (CCGMC)—1979 国外菌种中心国外菌种中心American Type Culture Collection http://www.atcc.orgJapan Collection of Microorganisms http://www.jcm.riken.go.jpThe United Kingdom National Culture collection http://www.ukncc.co.ukDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen http://www.dsmz.deATCC ATCC 美国菌种中心，最大的菌种中美国菌种中心，最大的菌种中心心, ,有病毒、细菌、真菌、细胞有病毒、细菌、真菌、细胞等不同的微生物等不同的微生物JCM JCM 日本微生物菌种中心日本微生物菌种中心英国国家菌种中心，英国国家菌种中心，Over 70,000 Over 70,000 micro-organisms and cell micro-organisms and cell lines are available. lines are available. 德国微生物与细胞收集中心德国微生物与细胞收集中心主要产酶菌主要产酶菌大肠杆菌大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌，一般分泌：应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶胞内酶。

因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌工程菌”也常在工业生产中应用于生产也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、门冬谷氨酸脱羧酶、门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶氨酸酶、限制性核酸内切酶等枯草杆菌枯草杆菌：工业上应用最广泛的产酶菌之一，：工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌等的产酶菌啤酒酵母啤酒酵母：工业上广泛应用，主要产：工业上广泛应用，主要产转化酶、醇脱氢转化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶酶、丙酮酸脱羧酶等曲酶（黑曲酶和黄曲酶）曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：：糖化酶、蛋白酶、果胶酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶脂肪酶等多种酶等多种酶提高酶产量的方法提高酶产量的方法Ø条件控制条件控制：优化发酵条件，包括：优化发酵条件，包括培养基：碳培养基：碳源、氮源、无机盐和生长因子、源、氮源、无机盐和生长因子、pHpH值、温度、值、温度、溶解氧、发酵周期等；添加诱导物、降低阻溶解氧、发酵周期等；添加诱导物、降低阻遏物浓度。

遏物浓度Ø遗传控制遗传控制：物理、化学法：物理、化学法诱变育种；诱变育种；基因重基因重组构建工程菌组构建工程菌（二）细胞破碎（二）细胞破碎Ø细胞壁的主要成分：细胞壁的主要成分： 细菌：肽聚糖：细菌：肽聚糖：N-N-乙酰萄糖胺，乙酰萄糖胺，N-N-乙酰乙酰 胞壁酸胞壁酸 真菌和酵母：萄聚糖，甘露聚糖真菌和酵母：萄聚糖，甘露聚糖 藻类：纤丝状多糖类藻类：纤丝状多糖类Ø细胞破碎的方法：细胞破碎的方法： 1 1）机械法）机械法 2 2）物理法）物理法 3 3）化学法）化学法 4 4）生物法（酶解））生物法（酶解） 1.1.机械法：机械法： 1 1）液体剪切：搅拌、匀浆液体剪切：搅拌、匀浆 2 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎固体剪切：研磨，珠磨，捣碎 2. 2.物理法：物理法： 1 1）超声波：通过剪切力和空穴作用）超声波：通过剪切力和空穴作用 （（3030mgmg蛋白蛋白/ /ml, 30-60sec/ml, 30-60sec/次）次） 2 2）渗透压突变：高渗（蔗糖，高盐）渗透压突变：高渗（蔗糖，高盐 等）平衡后迅速转入低渗溶液或水。

等）平衡后迅速转入低渗溶液或水 3 3）冻融：反复低温冰冻，室温融化冻融：反复低温冰冻，室温融化 4 4）冷冻干燥，再溶剂抽提冷冻干燥，再溶剂抽提 3.3.化学法：化学法： 1 1）有机溶剂处理：溶解膜脂，干燥，）有机溶剂处理：溶解膜脂，干燥， 抽提 2 2）表面活性剂处理，改变膜通透性，）表面活性剂处理，改变膜通透性， 使之溶解，再提膜蛋白常用使之溶解，再提膜蛋白常用 Triton-X100 Triton-X100等 4. 4.酶解法：酶解法： 应用溶菌酶，糖苷酶，萄聚糖酶，甘露应用溶菌酶，糖苷酶，萄聚糖酶，甘露 聚糠酶，纤维素酶等分解细胞壁聚糠酶，纤维素酶等分解细胞壁（三）酶的粗分离（三）酶的粗分离1.离心分离原理：原理：当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用旋转速度越高，运动物体所受到的受到离心力的作用。

旋转速度越高，运动物体所受到的受到离心力的作用旋转速度越高，运动物体所受到的受到离心力的作用旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行离心力越大如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行离心力越大如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行离心力越大如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒高速水平旋转，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒高速水平旋转，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒高速水平旋转，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴在相同转速相同转速相同转速相同转速条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的或高分子溶质会以不同的或高分子溶质会以不同的或高分子溶质会以不同的速率沉降速率沉降速率沉降速率沉降经过一定时间的离经过一定时间的离。

经过一定时间的离经过一定时间的离心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有效分离离心转速：低速离心机离心转速：低速离心机20002000～～60006000r/min，，高速离心机高速离心机18000～～25000r/min，，超速离心超速离心机机 40000~80000r/min实验室离心机实验室离心机温度类型：常温及冷冻温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型超速离心机均为冷冻型使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头，使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头，开盖关机开盖关机使用超速离心机时先抽真空使用超速离心机时先抽真空离心的形式离心的形式 角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式由低速到超速均有角式由低速到超速均有角式离心机和离心头（转子）角式离心机和离心头（转子） 角式离心头要配套，低温使用要预冷，角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、胶圈、旋紧操作注意稳、盖、胶圈、旋紧。

离心机的大小：落地式及台式离心机的大小：落地式及台式离心机操作离心机操作 平衡、定温、定速、定时、定刹车平衡、定温、定速、定时、定刹车离心机其他类型离心机其他类型 超超速速冷冷冻冻离离心心机机 立立式式螺螺旋旋过过滤滤离离心心机机活塞推料离心机活塞推料离心机 离离心心机机（（连连续续式式））(1) 蛋白质的盐溶与盐析蛋白质的盐溶与盐析盐溶：是指在适当的盐溶：是指在适当的中性盐浓度溶液中，蛋白质溶解度中性盐浓度溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象，称盐溶会提高的现象，称盐溶盐盐析析：：向向蛋蛋白白质质溶溶液液中中加加入入大大量量中中性性盐盐（（高高盐盐浓浓度度））时时，，会会破破坏坏蛋蛋白白质质分分子子表表面面的的水水化化层层（（即即破破坏坏了了蛋蛋白白质质在在水水溶溶液液的的稳稳定定性性因因素素））导导致致蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度降降低低发发生生沉淀析出，称盐析沉淀析出，称盐析常常用用的的饱饱和和硫硫酸酸铵铵沉沉淀淀法法分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质就就是是利利用用盐盐析析的的原原理理，，不不同同的的蛋蛋白白质质对对饱饱和和硫硫酸酸铵铵的的要要求求不不同同，，所所以以，，可可以以通通过过饱饱和和硫硫酸酸铵铵的的分分级级沉沉淀淀法法分分离离各各种种蛋蛋白白质。

质2. 浓缩技术盐析的影响因素盐析的影响因素1））pH：：等电点处最易沉淀等电点处最易沉淀2）蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓）蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，易共沉淀，2.5%-3%最好盐析操作盐析操作ØØ低饱和度低饱和度：饱和溶液滴加法易于迅速：饱和溶液滴加法易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过混合均匀，一般终饱和度不超过40％ØØ高饱和度高饱和度：固体盐添加法不会大量增：固体盐添加法不会大量增加溶液体积加溶液体积ØØ温和搅拌温和搅拌中缓慢加盐加毕继续搅拌中缓慢加盐加毕继续搅拌10分钟以上，以充分沉淀分钟以上，以充分沉淀ØØ沉淀后需沉淀后需高速离心高速离心ØØ沉淀再溶解后可能需要沉淀再溶解后可能需要除盐(2) 聚乙二醇沉淀聚乙二醇沉淀原理：原理：1）聚乙二醇可与蛋白质分子形成复合物，除）聚乙二醇可与蛋白质分子形成复合物，除去水分子外壳，导致沉淀去水分子外壳，导致沉淀        2）空间排阻学说：聚乙二醇在溶液中形成网）空间排阻学说：聚乙二醇在溶液中形成网状结构，与蛋白质分子发生空间排挤作用，状结构，与蛋白质分子发生空间排挤作用，使之沉淀使之沉淀聚乙二醇沉淀影响因素聚乙二醇沉淀影响因素1）蛋白质分子量越大越易沉淀，即）蛋白质分子量越大越易沉淀，即a值越值越大，沉淀所需聚乙二醇浓度越低。

大，沉淀所需聚乙二醇浓度越低2）不能浓度太大，一般不超过）不能浓度太大，一般不超过10mg/ml3））温度在温度在20℃ 分辨率最高，分辨率最高，0－－30℃可应可应用4）聚乙二醇聚合度高易使蛋白沉淀，但因）聚乙二醇聚合度高易使蛋白沉淀，但因粘度影响操作，多采用聚乙二醇粘度影响操作，多采用聚乙二醇60005））2.5以下离子强度，等电点附近以下离子强度，等电点附近pH为好(3) (3) 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 在待分离的酶液中加入与水互溶的有机溶剂在待分离的酶液中加入与水互溶的有机溶剂使溶液介电常数降低，酶蛋白分子间引力增大而使溶液介电常数降低，酶蛋白分子间引力增大而相互产生聚集，从而降低溶解度而析出沉淀相互产生聚集，从而降低溶解度而析出沉淀实际操作中常用的有机溶剂有实际操作中常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇乙醇、丙酮、异丙醇和甲醇和甲醇等Ø温度温度 0℃ 0℃下操作有机溶剂先在下操作有机溶剂先在-15 ℃ -15 ℃ ～～ - - 20℃20℃下预冷，沉淀后立即在低温下离心分离下预冷，沉淀后立即在低温下离心分离 ØpH = pH = pIpI Ø沉淀后马上用缓冲液溶解，减少有机溶剂浓度。

沉淀后马上用缓冲液溶解，减少有机溶剂浓度三、细分离与纯化（一）大规模层析技术层析系统层析系统ÄKTA purifier-ÄKTA purifier-high performancehigh performanceÄKTA ÄKTA FPLCFPLCWaters 2690Waters 2690常压层析系统常压层析系统中压层析系统中压层析系统高压层析系统高压层析系统HP 1100HP 1100层析装置层析装置 梯度混和器，蠕动泵，层析柱，监测梯度混和器，蠕动泵，层析柱，监测仪，记录仪，收集器仪，记录仪，收集器层析柱层析柱记录仪记录仪低温层析柜低温层析柜层析操作流程层析操作流程处理介质处理介质装柱装柱平衡平衡上样上样洗脱洗脱介质再生介质再生根据分子量大小范围选择凝胶颗粒细的分辩根据分子量大小范围选择凝胶颗粒细的分辩率高率高, ,流速慢；粗的分辩率低流速慢；粗的分辩率低, ,流速快装柱均匀，不能有气泡装柱均匀，不能有气泡用缓冲液平衡，直到基线稳定用缓冲液平衡，直到基线稳定按柱床体积按柱床体积2-5%2-5%上样以一定流速，用缓冲液洗脱，收集目标蛋白以一定流速，用缓冲液洗脱，收集目标蛋白。

按照水按照水- -稀碱稀碱- -水洗涤，为防止微生物生长，保存水洗涤，为防止微生物生长，保存0.02% 0.02% NaN3NaN3或或20%20%乙醇中，注意乙醇中，注意NaN3NaN3可能抑制目标酶可能抑制目标酶1 1、凝胶过滤层析（分子筛层析）、凝胶过滤层析（分子筛层析） 是根据分子大小分离蛋白质混合物的是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一最有效方法之一ØØ原理原理: :当不同分子大小的蛋白质流经凝胶当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时层析柱时, ,比凝胶比凝胶孔径大孔径大的分子不能进入的分子不能进入珠内珠内网状结构网状结构, ,而被而被排阻排阻在凝胶珠在凝胶珠之外之外随随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外最先流出柱外; ;比比网孔小网孔小的分子能不同程的分子能不同程度地度地自由出入自由出入凝胶珠的内外这样由于凝胶珠的内外这样由于不同大小的分子所经的不同大小的分子所经的路径路径不同而得到不同而得到分离分离, ,大分子物质先被洗脱出来大分子物质先被洗脱出来, ,小分子小分子物质后被洗脱出来物质后被洗脱出来。

 凝胶过滤常用的介质凝胶过滤常用的介质：：在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒交联葡聚糖（交联葡聚糖（SephadexSephadex，是由葡聚糖与环氧氯丙烷，是由葡聚糖与环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物）交联形成的有三维空间的网状结构物） 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶2、离子交换层析基本原理基本原理基本原理基本原理 离子交换树脂共价连接有离子交换树脂共价连接有离子交换树脂共价连接有离子交换树脂共价连接有可解离基团可解离基团可解离基团可解离基团，可人，可人，可人，可人为选择性地使其为选择性地使其为选择性地使其为选择性地使其带上电荷带上电荷带上电荷带上电荷，带，带，带，带正正正正电荷的为阴离电荷的为阴离电荷的为阴离电荷的为阴离子交换树脂，带负电荷的为子交换树脂，带负电荷的为子交换树脂，带负电荷的为子交换树脂，带负电荷的为阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂生物大分子表面带电荷，通过静电键可结合在生物大分子表面带电荷，通过静电键可结合在生物大分子表面带电荷，通过静电键可结合在生物大分子表面带电荷，通过静电键可结合在相应的树脂上。

相应的树脂上相应的树脂上相应的树脂上亲和力亲和力亲和力亲和力大小取决于可形成的大小取决于可形成的大小取决于可形成的大小取决于可形成的静静静静电荷数目电荷数目电荷数目电荷数目，及，及，及，及排布方式排布方式排布方式排布方式有关，不同大分子会有有关，不同大分子会有有关，不同大分子会有有关，不同大分子会有不同亲和力不同亲和力不同亲和力不同亲和力 改变环境的改变环境的改变环境的改变环境的离子强度离子强度离子强度离子强度或或或或pHpHpHpH值值值值使表面电荷变化，使表面电荷变化，使表面电荷变化，使表面电荷变化，会改变相应亲和力，从而改变大分子在树脂上会改变相应亲和力，从而改变大分子在树脂上会改变相应亲和力，从而改变大分子在树脂上会改变相应亲和力，从而改变大分子在树脂上的的的的吸附状态吸附状态吸附状态吸附状态，达到分离目的达到分离目的达到分离目的达到分离目的 洗脱方法洗脱方法1 1）增加缓冲液离子强度，既增大离子在树）增加缓冲液离子强度，既增大离子在树脂上的竞争，同时减少大分子表面电荷，脂上的竞争，同时减少大分子表面电荷，降低吸附力，从而使大分子由树脂上解降低吸附力，从而使大分子由树脂上解析。

析2 2）改变）改变pHpH，，减少蛋白分子表面解离基团的减少蛋白分子表面解离基团的解离度，降低吸附力，从而使大分子解解离度，降低吸附力，从而使大分子解析但改变过多可能使蛋白变性但改变过多可能使蛋白变性 有时两种方法可以结合使用有时两种方法可以结合使用洗脱方式洗脱方式1 1）梯度洗脱）梯度洗脱 洗脱液的离子强度或洗脱液的离子强度或pHpH连续改变，使连续改变，使混合物中各个蛋白先后进入有限吸附至混合物中各个蛋白先后进入有限吸附至不吸附状态而被洗脱不吸附状态而被洗脱 注意：注意： 总体积要足够大，使各分离峰不太拥挤；总体积要足够大，使各分离峰不太拥挤；梯度上限要足够高，使各物质都能解析；梯度上限要足够高，使各物质都能解析；梯度斜度适当，过大各峰不易分开，过梯度斜度适当，过大各峰不易分开，过小使峰形过宽和拖尾小使峰形过宽和拖尾2 2））阶段洗脱阶段洗脱         用不同离子强度或用不同离子强度或pH的洗脱液按洗脱的洗脱液按洗脱能力由小到大相继进行洗脱能力由小到大相继进行洗脱 优点：优点：   洗脱峰集中，体积小浓度高；所需洗脱洗脱峰集中，体积小浓度高；所需洗脱液总量少，时间短；设备和操作简单。

液总量少，时间短；设备和操作简单 缺点：缺点：   洗脱峰纯度可能不够高；洗脱峰经常有洗脱峰纯度可能不够高；洗脱峰经常有拖尾；变一次洗脱液就会有一个峰，有拖尾；变一次洗脱液就会有一个峰，有时一个成分二个峰，造成假象时一个成分二个峰，造成假象两种离子交换剂两种离子交换剂ØØ阴离子交换剂：带正电荷，吸附带阴离阴离子交换剂：带正电荷，吸附带阴离子的大分子，交换原吸附的小分子阴离子的大分子，交换原吸附的小分子阴离子ØØ常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-2-羟羟丙基丙基 阳离子交换剂：带负电荷，吸附带阳阳离子交换剂：带负电荷，吸附带阳离子的大分子，交换原吸附的小分子阳离子的大分子，交换原吸附的小分子阳离子 常用羧甲基，常用羧甲基， 磺丙基磺丙基3. 3. 亲和层析亲和层析Ø亲亲和和层层析析：：利利用用蛋蛋白白质质分分子子对对其其配配体体分分子子特特有有的的识识别别能能力力，，建立起来的一种有效的纯化方法建立起来的一种有效的纯化方法Ø配配基基：：酶酶的的底底物物、、辅辅酶酶、、抑抑制制剂剂、、效效应应物物及及其其结结构构类类似似物物，，激素与受体蛋白，抗原与抗体等。

激素与受体蛋白，抗原与抗体等Ø亲亲和和层层析析的的原原理理：：亲亲和和层层析析树树脂脂上上接接有有特特定定的的生生物物大大分分子子配配基基，，可可专专一一地地结结合合特特定定生生物物大大分分子子变变换换洗洗脱脱条条件件时时，，即可将该分子洗脱，实现分离提纯即可将该分子洗脱，实现分离提纯亲和层析的原理亲和层析的原理4、高效液相层析(HPLC)  HPLC纯化蛋白质的报告大多局限于实纯化蛋白质的报告大多局限于实验室规模验室规模(数毫克到数十毫克数毫克到数十毫克)   Waters公司的公司的HPLC已备有大规模制备的已备有大规模制备的层析柱    将亲和层析的高分辨力和将亲和层析的高分辨力和HPLC的快速结的快速结合合 　 高效液相层析法的基本概念和分离理论与经高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致典的液相色谱法及气相色谱法一致      高效液相层析仪高效液相层析仪 典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分流动相用高压泵输入柱与检测系统三部分流动相用高压泵输入。

       一般用微量注射器直接进样，也可采用六通一般用微量注射器直接进样，也可采用六通阀门进样阀门进样HPLCHPLC中所用的检测器最多应用的是紫中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测外吸收检测(UV)(UV)，灵敏度可达，灵敏度可达ngng水平此外，还水平此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等高效液相层析仪的结构简图高效液相层析仪的结构简图（二）大规模电泳技术 ØØ三个优点三个优点: : ① ①处理样品的速度高处理样品的速度高, ,每小时可达每小时可达1 1g;g; ② ②产品纯度高产品纯度高( (一般能达到均一状态一般能达到均一状态);); ③ ③回收率高回收率高, ,大于大于95%95% 常用的电泳种类常用的电泳种类Ø区区带带电电泳泳：：在在支支持持物物上上电电泳泳时时，，蛋蛋白白质质混混合合物被分离成若干区带物被分离成若干区带Ø凝凝胶胶电电泳泳：：凝凝胶胶有有分分子子筛筛效效应应，，可可更更好好分分离离如常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（如常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）Ø等电聚焦电泳等电聚焦电泳：：等电聚焦（（1）基本原理）基本原理            根据蛋白质分子的等电点进行分离。

利用这种技术根据蛋白质分子的等电点进行分离利用这种技术分离蛋白质混合物是在具有分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行，在外梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质将移向并聚集（停留）在等加电场作用下，各种蛋白质将移向并聚集（停留）在等于其等电点的于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带梯度处，并形成一个很窄的区带2）优点及主要用途）优点及主要用途          加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定pI，分离速度快，分离的蛋白质不变性可用于蛋白质，分离速度快，分离的蛋白质不变性可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质pI的测定3）基本操作）基本操作1、胶的制备、胶的制备(需两性电解质）需两性电解质）  2、加样和电泳、加样和电泳   3、染色和、染色和脱色脱色 酶制剂的价格与其活力及纯度有很大关系酶制剂的价格与其活力及纯度有很大关系大规模使用的酶纯度很底，价格便宜，可以大大规模使用的酶纯度很底，价格便宜，可以大批购到纯度很高的酶价格较为昂贵纯度很高的酶价格较为昂贵，与工业，与工业用酶相比，他们使用量较少，在制备时需使用用酶相比，他们使用量较少，在制备时需使用纯化技术和高劳务费用。

某些特定的研究用酶，纯化技术和高劳务费用某些特定的研究用酶，他们的使用量有限，酶活力对环境要求严格，他们的使用量有限，酶活力对环境要求严格，因此往往需要特制，价格极其昂贵因此往往需要特制，价格极其昂贵。