流式细胞术的工作原理与发展综述.docx

班级：临床医学（五年制）1507班姓名：刘香贺学号：流式细胞术的工作原理与发展综述摘要：流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能迅速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术是一项多学科交叉研究的结晶流式细胞术及流式细胞仪的浮现融合了医学，计算机学，物理学等众多学科背景它不仅测量速度快、精确度好、敏捷度高，并且还具有客观、直接和测量参数多的长处目前，该技术已普遍应用于肿瘤学、血液学、免疫学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等领域本文针对其发展历史及目前应用作一综述流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能迅速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术 从其发明到如今在临床和实验室的广泛应用，每一步都凝结了电子技术、流体力学、计算机科学、激光技术、生物学、生物技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的构造及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。

因其在量上的精确性及其在质上的特异性，流式细胞术在药学，肿瘤学、血液学、免疫学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学，生物材料等众多研究领域得到了广泛的应用也获得了长足的进步1. 流式细胞术的工作原理流式细胞术的基本原理和措施是将待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后，制成样品悬液，排成单列的样品经流动室的喷嘴喷出成为样品液流，与激光束相交时，样品被激发产生荧光，荧光检测器为光电倍增管，同步还可以光电二极管检测与样品大小有关的散射光，而散射光又分为前向散射光（FS）与侧向散射光（SS）（详见后述）测得的FS与SS信号通过计算机解决，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选流式细胞术对细胞的分析要基于流式细胞仪才干实现流式细胞仪的基本构造分为三部分——液流系统，光学系统，数据解决系统一方面待测细胞或微粒进入液流系统，待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本,在一定气体压力下将待测样品压入流动室,用不含细胞或微粒的缓冲液(又称鞘液)在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度,使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动,形成一种圆形的流束(即鞘流),待测细胞在鞘液的包裹下单行排列,依次通过流式细胞仪的检测区域。

如下图）继而液流进入光学系统，液流通过测量区的细胞被激发而产生荧光，在与入射光束和液柱垂直方向放置光学系统(透镜光栏、滤片、检测器)用以收集信号（如下图）细胞在液柱中与激光束相交时向周边360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，（如下图）重要分为前向散射光和侧向散射光前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部构造属性这些荧光信号的强度代表所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内、核内物质的浓度,经光电倍增管接受后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将持续的电信号转换为可被计算机辨认的数字信号计算机采集所测量到的多种信号进行计算解决,将分析成果显示在计算机屏幕上,也可以打印出来,还可以数据文献的形式存储在硬盘上,以备后来的查询或进一步分析检测数据的显示视测量参数的不同而有多种形式可供选择单参数数据以直方图的形式体现,其x轴为测量的散射光或荧光的强度(可以是线性轴,也可以选择对数轴),纵轴为相对细胞数。

一般来说,流式细胞仪坐标轴的辨别率有256或1024通道数,这视其模/数转换器的辨别率而定对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的散点图、等高线图或三维的立体视图等由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选分选原理如上图5）2. 流式细胞术的发展历史流式细胞术是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,80年代开始从基本研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测国内在80年代初引进了第一台流式细胞仪具体发展历程如下[1]：1930年,Casperrsson和Thorell开始致力于细胞的计数;1934年,Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人,她试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量;1936年,Caspersson等引入显微光度术;1940年,Coons提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白;1947年,Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器;1949年,Coulter提出在悬液中计数粒子的措施并获得专利;1950年,Caspersson用显微分光光度计在紫外(UV)和可见光光谱区检测细胞;1953年,Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理,成功地设计红细胞光学自动计数器;1953年,Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形;1954年,Beirne和Hutchcon发明光电粒子计数器; 1959年,B型Coulter计数器问世;1965年,Kamemtsky等提出两个设想:(1用分光光度计定量细胞成分;(2)结合测量值对细胞进行分类;1967年,Kamemtsky和在.Moldaven的措施基本上提出细胞分选的措施;1969年,Van Dilla Fulwyler及其同事们在LosALmos,NM(目前的National Flow Cytometry Resource Labs)发明第一台荧光检测细胞计;1972年,Herzenberg研制出一种细胞分选器的改善型,可以检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号;1975年,Kochler和Milstein提出单克隆抗体技术,为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基本。

3. 流式细胞术的应用3.1流式细胞术在医学中的应用3.1.1流式细胞术在肿瘤学中的应用[2]癌细胞与正常体细胞最明显的区别就是细胞DNA含量发生变化或形态异常，以及细胞生长周期的变化运用FCM进行细胞周期分析、DNA倍体分析、定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等,从而获得组织形态学措施难以得到的信息,可为肿瘤的临床诊断、治疗和避免提供协助 3.1.2流式细胞术在血液学中的应用 血液中的细胞在发育过程中细胞表面体现出不同的抗原，运用特有的荧光标记可以检测其荧光强度判断血细胞发育生长正常与否，特别在急性白血病的诊断中，运用不同类型白细胞表面体现出的抗原种类及量的不同，流式细胞术可以较为客观地诊断急性白血病及其分型，也可以检测出骨髓正常细胞中万分之一的白血病细胞，进行微小残留病的检测此外，在造血干细胞移植后，需使用流式细胞术监测移植患者免疫重建的状况，如淋巴细胞亚群分析流式细胞术在治疗有关血小板减少的疾病[3]中也起到了重要作用外周血小板减少的病因重要有: ( 1) 骨髓造血功能障碍; ( 2) 血小板破坏过多; ( 3) 储存池异常。

网织血小板检测可以较好地辨别血小板减少的病因网织血小板内部具有残存的 RNA，噻唑橙( TO) 可与血小板内的 RNA 结合，发出绿色荧光其荧光强度与 RNA 含量正有关由此，可以检测网织血小板的百分含量骨髓造血机能障碍引起的血小板减少( 再生障碍性贫血) ，网织血小板下降; 免疫性血小板破坏增长导致的血小板减少( 特发性血小板减少性紫癜) 网织血小板上升[4]也可以用流式细胞术检测血小板有关免疫球蛋白来拟定免疫性血小板减少[5]进一步可以检测 血小板释放的微粒( platelet microparticles，PMPs) ，分析血小板功能3.1.3流式细胞术在免疫学中的应用流式细胞术中对随着单克隆抗体技术、荧光色素化学等技术的发展,流式细胞术成为现代技术的“杂交体”正像免疫学作为一种不断发展的学科和技术手段延伸到生物、医学及其她领域同样,流式细胞术也以它的迅速、灵活和定量的特点,广泛地被应用于免疫理论研究临床实践应用的各方面,因此有人称之为现代免疫技术基石之一特别同单克隆抗体结合应用,在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监督、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面都起着相称重要的作用。

[6]3.2流式细胞术在药学中的应用[7]流式细胞术作为一种在细胞、受体及分子水平的定量分析措施,在药物滥用，多药耐药基因，体外药敏实验的研究中已成为一种非常重要的手段例如：老式的药物敏感实验的措施涉及试管肉汤稀释法和琼脂稀释法,以及纸片扩散法、微量稀释法和E-实验等此等措施忽视细胞个体间的异质性,一般仅提供群体细胞的均值,且费时费力将流式细胞术应用于细菌药实验,用荧光探针来标记细菌细胞的特性,通过仪器测定药物对细菌个体生长的影响,可以检测到群体中具有异质性的菌细胞,因此较其她措施更为精确、敏感和迅速在国外FCM甚至已被建议作为细菌常规药敏实验[8]再如流式细胞术在肿瘤学的基本和临床研究中都已有很成熟的应用;药物与肿瘤的关系也有报道,如:刘屏[9]等用流式细胞仪观测了吗啡依赖小鼠T淋巴细胞周期的变化状况,发现胸腺细胞的DNA合成期和增殖分裂期均受到克制3.3应用流式细胞术应注意的问题3.3.1荧光检测[10]实验过程中，流式细胞仪所检测到的荧光信号重要涉及三部分: ( 1) 细胞自发荧光来自于细胞代谢过程中的自发荧光的分子，如核黄素、细胞色素等，其含量越高，自发荧光越强; ( 2) 非特异性结合。

标记荧光素的抗体，除了与细胞表面的抗原特异性结合外，其 Fc 段也可与细胞表面 Fc受体结合，以及抗体蛋白与细胞蛋白质之间的吸附作用; ( 3) 特异性结合这是单克隆抗体与细胞抗原的特异性结合前两种荧光为实验“噪音”，后一种荧光是我们需要的信号为了得到对的的检查成果，必须排除前两种荧光的干扰重要措施是以同型对照为参照，来拟定检测细胞与否体现相应抗原需要强调的是不同细胞自发荧光强度不同，在外周血里面，单核细胞自发荧光最强，粒细胞次之，淋巴细胞最弱，培养的细胞自发荧光更强3.3.2对的设门得到实验成果后，先对的设门才干进行故意义的分析比较，例如下图6中的实验成果，若在103处设门，则实验比较不出成果3.3.3荧光补偿多色流式细胞术分析，多种荧光颜色之间会互相干扰，需要用补偿减去干扰的光源不同荧光素发出的荧光，以及荧光的强弱都影响补偿值，也与仪器的滤光片狭缝有关做补偿调节的原则，应以“横平竖直”为准不同仪器、不同细胞、不同厂家试剂，其补偿值各不相似如何做好荧光补偿调节，是流式细胞分析操作的难点，特别在检测弱抗原体现时候，会直接影响检测成果4. 流式细胞术新技术[11]4.1液相芯片技术生物芯片技术是近年来随着人类基因组筹划和蛋白质组筹划的进展在生命科学领域中迅速发展起来的一项新技术,现已被人们所熟知。

将生物芯片技术和FCM有机结合在一起,把不同生物探针(核酸、蛋白等)标记在多种有荧光的微球上,以荧光标记微球作为反映载体在液相系统中完毕生物学反映,即为流式细胞术液相芯片技术它构成由微球体+探针+目的分子+报告分子的一种简朴反映模式可以在同一液相中同步检测多种目的分子如对血液中多种白细胞介素检测4.2定量流式细胞分析定量流式细胞分析(quantitative flow cytometry QFCM)是指用流式细胞术对细胞或微。