8-利用互联网和计算机辅助基因分析鉴定细菌.ppt

实验实验9：利用互联网和计算机辅助基因分析鉴定细菌：利用互联网和计算机辅助基因分析鉴定细菌1.实验器材实验器材计算机和联网辅助设施，安装有计算机和联网辅助设施，安装有Internet Explorer浏览器，浏览器，软件：软件：Clustalx1.8；Mega2.1（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）2.实验目的实验目的学习并掌握16S rRNA序列进行细菌鉴定的基本原理和方法学习并掌握利用Clustalx1.8和Mega2.1两款软件建构基于16S rRNA的系统发育树3.基本原理基本原理 细菌的鉴定、分类经典方法包括形态观察、染色、生理生化反应和多项微量简易检测技术等，而现在DNA检测技术和生物信息学为细菌鉴定提供了新的方法基本原理基本原理是亲缘关系越近的种类，其DNA序列相似度越高，一般选择所有生物都有的基因来进行对比，使用得最为普遍的是编码核糖体小亚基16S rRNA的DNA序列 目前，核糖体RNA基因序列已被广泛用于原核、真核生物多样性研究，构建系统进化树，这是由于使用rRNA具有以下几个优点：首先，所有真核与原核生物都含有核糖体和核糖体RNA，亲缘关系较近的两种生物之间的rRNA碱基序列差异小于两种亲缘关系较远的rRNA碱基序列差异；它们的生理功能既重要又恒定；在细胞中含量较高，便于提取；其次，RNA基因高度保守，变异相对较少，适宜作为分类参考基因；最后，rRNA分子大小适中，测序方便。

操作步骤：1. 登陆Genebank网站“www.ncbi.nlm.nih.gov”，当主业打开后，点击页面右侧“BLAST”连接进入粘贴进行比粘贴进行比对菌株的对菌株的16S rRNA序列序列点击后开始进行同源搜索点击后开始进行同源搜索一般默认搜索一般默认搜索100条相似性从高至低排列的同源序列条相似性从高至低排列的同源序列可根据需要进行设置可根据需要进行设置登陆号登陆号点击进入分别点击进入分别获取各菌株的获取各菌株的16S rRNA基基因序列因序列菌株名菌株名1.可以根据相似性从高质低的情况，最鉴定的菌株种类进行初步判断可以根据相似性从高质低的情况，最鉴定的菌株种类进行初步判断2.进而挑选不同同源性菌株进行系统发育树的构建，进一步确认进而挑选不同同源性菌株进行系统发育树的构建，进一步确认挑选菌株种名明确的（包含属名和种名），一般每种挑选菌株种名明确的（包含属名和种名），一般每种菌挑选两个不同登陆号，分别获取它们的菌挑选两个不同登陆号，分别获取它们的16S rRNA序列信息总共获取序列信息总共获取7种不同菌，共种不同菌，共14条序列信息，条序列信息，加上待鉴定的序列，总共加上待鉴定的序列，总共15条。

条点击“登陆号登陆号”进入后显示的16S RNA序列1. 把序列复制到把序列复制到TXT文档当中，去除序列前面的阿拉伯序列编号文档当中，去除序列前面的阿拉伯序列编号将序列制作成以下格式（将序列制作成以下格式（FASTA 格式）格式） 大于号（大于号（>））+登陆号登陆号TXT文档可命名为菌株拉丁名文档可命名为菌株拉丁名+登陆号，以方便后面系登陆号，以方便后面系统树修改统树修改分别将每一个菌株的分别将每一个菌株的16S rRNA制作成一个制作成一个TXT文章，保存文章，保存在一个文件夹下，包含你要鉴定的菌株序列在一个文件夹下，包含你要鉴定的菌株序列 利用利用ClustalX1.8软件进行同源比对软件进行同源比对 把序列一一加载到软件当中，加载第一把序列一一加载到软件当中，加载第一条序列时候用条序列时候用“Load Sequences”，加，加载剩下的其余序列用载剩下的其余序列用“Append Sequences”加载完序列后运行同源比对加载完序列后运行同源比对“Do complete Alignment” 设置同源比对结果的保存路径设置同源比对结果的保存路径改完后点击改完后点击“ALIGN”运行软件运行软件比对完成后关闭比对完成后关闭ClustalX软件，这时会在软件，这时会在D盘根目录下盘根目录下形成两个文件形成两个文件*.aln和和*.dnd 。

运行运行MEGA2.1软件软件点击加载D盘根目录下的“*.aln”删去前端长于鉴定菌删去前端长于鉴定菌16S rRNA序列的其他菌的基因序列序列的其他菌的基因序列按住键盘“ALT”键后，用鼠标选取前端冗余序列后按”Delete”删去；末端末端也进行同样也进行同样操作操作先点这先点这再点这再点这弹出对话框弹出对话框确认点击确认点击点击关闭点击关闭点击点击“Yes”点击加载D盘根目录下的“*.mega”关闭退出后，会再次回到如下界面：关闭退出后，会再次回到如下界面：再次点击再次点击“Click me to activate a data file”找到找到D盘根目录下的盘根目录下的“*.mega”文件选中文件选中后，点击后，点击“打开打开”选择左边的选择左边的“Nucleotide sequences”后，点后，点击击“OK”弹出对话框，点击弹出对话框，点击“Yes” “OK”，会再次回到初始界面，会再次回到初始界面设置完成后，点击设置完成后，点击“OK”再次回到初始界面再次回到初始界面点击进行复制，粘贴点击进行复制，粘贴到到word里进行编辑里进行编辑 SJ060621 Listonella anguillarum [AY963631] Listonella anguillarum [AY963632] Vibrio ordalii [AY530930] Vibrio ordalii [AY628646] Vibrio aestuarianus [AJ845014] Vibrio aestuarianus [AJ845015] Vibrio vulnificus [X76334] Vibrio vulnificus [BA000038] Vibrio lentus [AY292936] Vibrio lentus [AY292935] Vibrio kanaloae [AM162657] Vibrio pomeroyi [VPO491290] Vibrio splendidus [AJ874359] Vibrio splendidus [AB038030] Vibrio chagasii [VSP490157]1001001001005153999097509939540.002 加上登陆号所对应的菌株拉丁名加上登陆号所对应的菌株拉丁名。