人DRD1基因启动子区的克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建.doc

人DRD1基因启动子区的克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建王春红李哲王明菡邓丽丽王欢［摘要］目的：本研究通过克隆人多巴胺受体(dopamine receptor, DRD)1基因的启动子区，构建贪有该棊因启动子序列的双荧光素酶报告棊因载体并检 测其活性，为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具方法：以人静脉血基因 组DNA为模板，通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pGM-T载体，测 序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告棊因质粒pGL3-Basic,构建含有 DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体，采用阳离子脂质体法与内对照质粒 PGL3-TK共转染人真核细胞系HEK-2293,同时以不含启动子的pGL3-Basic载体与 内对照质粒PGL3-TK共转染作为阴性对照组，化学发光仪检测相对荧光强度结 果：通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列 正确与阴性对照组相比，该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性结论： 成功构建丫含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告棊因载体，为研宂该棊因的 转录调控提供了基础工具［关键词］多巴胺受体D1基因双荧光素酶报告基因启动子克隆D0l:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.32.25作者单位：110034,辽宁沈阳，沈阳医学院公共卫生学院毒理教研室前言多巴胺作为一种N源性神经递质，主要通过多巴胺受体调控其功能。

多巴胺 受体是能与多巴胺特异性结合而发挥其调节效应的蛋白类物质多巴胺受体 (dopamine receptor, DRD)为七个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族，目前己 分离出五种类型(DRD1〜DRD5)人类DRD五种亚型的棊因位于不同的染色体 上DRD1基因位于第5号染色体短臂37区5带(5p37.5),全长3489bp ［1］人 和大鼠的DRD1基因编码产物均为466个氨基酸，其同源性为91%，而跨膜部分 的同源性为96%DRD1受体基因的mRNA在纹状体、伏隔核和嗅结节等部位表 达丰富，这些区域中DRD1受体的表达量也非常高［2】DRD1基因启动子区的多 态性位点会通过调控转录活性来影响多巴胺受体1的产量，进而影响多巴胺神经 递质的代谢，奋研究发现该基因启动子区的核苷酸多态性位点可能与精神分裂症， 双相情感障碍等疾病的发生有关［3-7］目前，对DRD1基因启动子区的研究其多，但仍未得出一个统一的结论，且 很多研宄多局限在对单独某一位点与疾病的冋顾性分析，并未对具体调控做细致 的分析本研究拟通过构建含有DRD1基因启动子区序列的荧光素酶报告基因载 体，细胞转染验证其表达活性，为进一步深入研究该基因的转录调控机制提供基 础工具。

材料与方法人DRD1基因启动子克隆取枸橼酸钠抗凝的人静脉血3ml置于试管中，应用酚-氯仿法提取基因组DNA, 所得DNA沉淀加适量的TE (10mol/L Tris-HCI, lmol/L EDTA pH8.0)溶解，溶解后的DNA于4C保存应用Primer 5.0软件设计特异性引物，根据pGL3-Basic载体(Promega，美国)多克隆位点选定限制性内切酶(见图1)划线部分分别为Kpnl和Bgl2的酶切识别位点，引物委托生物公司合成(TaKaRa,大连)PCR反应条件为：预变性95"C 5min；变性95C lmin,复性60C 30s,延伸72C 2minlOS,循环35次；终末延伸72C 5min扩增片段长度2001bp (-1990〜+10)采用浓度1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的PCR产物紫外光下切胶，并按照Gel DNA Extraction Kit (TaKaRa)说明书的操作步骤进行纯化纯化后的PCR产物通过DNA A-Tailing Kit （TaKaRa）在3’端加一个碱基A后与pGM-T载体（天跟，北京）连接，转化感受态细胞TOP10 （天 跟），Kpnl和Bgl2 （Thermo,美国）双酶切及测序验证插入的片段。

验证无误 的质粒在双酶切后切胶纯化，与pGL3-Basic载体的连接使用无内毒素质粒大量 提取试剂盒（博迈德，北京）提取重组后的报告基因质粒，内对照质粒PGL3-TK 和阴性对照质粒pGL3-Basic转染HEK293细胞于DMEM/高糖培养基（含10%胎牛血清）（Hyclone,美国）,37C， 5%CO2浓度，100%相对湿度条件下培养将重组质粒和阴性对照质粒pGL-Basic 稀释至100ng/μl,内对照质粒pRL-TK稀释至10ng/μl；然后将S组质粒 和阴性对照质粒pGL-Basic与内对照质粒pRL-TK按5:1,10:1,20:1混合选择对数 生长期细胞接种于24孔板（l×105/孔），待细胞生长密度达80-90%，且分 布均匀即可进行转染使用Lipofectamine? 3000 （Invitrogen,美国）转染,转染 后培养6h后更换新鲜的DMEM培养基，转染后的24h收集细胞双荧光素酶活性分析将上诉24孔板中的细胞用500μll×PBS洗涤一次，弃液，加入 100μl新鲜配置的l×PLB裂解液与室温下在摇床震荡20min以充分裂 解细胞。

在0.5ml检测管中依次加入100μILAR2溶液，20μl裂解液，混 匀后将检测管放入Lumat3 LB9508管式发光检测仪（Berthold,德国）检测孔中， 延迟3s,检测吋间10s,测定出萤火虫荧光素酶的活力，然后在检测管中加入 100&mU;l新鲜配置的l×STOP液，混匀后再检测海肾荧光素酶的活力计 算两种荧光素酶的活力比值，即相对荧光强度结果用PCR扩增和DNA重组技术，将5’端调控区片段（-1990〜+10）定向克隆到pGL3-BasiC质粒中，构建重组的荧光素酶报告基因质粒重组质粒经过 Kpnl和Bgl2限制性内切酶的双酶切后，酶切片段长度2001bp，琼脂糖凝胶电 泳鉴定结果见图2,酶切片段的长度与设计长度一致测序结果显示插入片段与0的片段的序列完全一致重组质粒的荧光素酶活性分析以pRL-TK载体作为转染的内参，pGL3-Basic载体作为荧光素酶活性的阴性对 照，测定DRD1基因5&rSqU0;端启动子区的重组载体转染人胚肾293细胞后的荧 光素酶相对活性实验结果表明DRD1基因5&rSqU0;端启动子区重组载体能表达 荧光素酶。

细胞共转染的效率受多种因素的影响，如细胞密度、脂质体和质粒的 比例以及两个质粒之间的比例等，为了优化重组载体和内对照载体的比例，本实 验使用3种不同比例进行共转染后发现以10:1比例转染的效果最好（图3）讨论本研究选择位于起始密码上游的片段作为目的片段（-1990〜+10），片段长 度2001bp通过对pGL3-Basic载体多克隆位点的查阅，我们选择Kpnl和Bgl2 限制性内切酶识别位点来构建克隆载体由于待插入的片段较长，我们先通过 TA克隆筛选出具冇黏性末端的片段,再与表达载体进行连接因为TA克隆简单， 成功率高，PCR扩增产物通过加A反应在末端加一个碱基A，而T载体的缺U奋 一个凸出的T，正好可以配对该TA克隆技术比其他的PCR克隆方法有更高的 重组效率，一般超过90%的阳性克隆含冇0的DNA片段[8,9]o我们选用萤火虫荧光素酶表达载体检测转录活性主要有如下的优点：荧光素 酶的测定非常灵敏，不需要放射性物质；其分析的线性范围可以超过8个数量级, 因此少量细胞的裂解产物就可以满足实验需要；荧光素酶分析还可以在96孔板 里进行，方便大量转染细胞后的测定在双荧光素酶报告基因系统中，以TK启 动子转录的海肾腔肠荧光素酶作为内对照，可以降低细胞数B和状态、转录和裂 解效率等差异造成的误差，使得结果更加可靠和准确[10,11]。

人HEK293细胞系胚胎肾细胞经腺病毒DNA剪切后转化而来免疫染色，免 疫印迹和微列阵分析表明该细胞表达神经丝（neurofilament，NF）亚基，NF-L, NF-M和NF-H以及通常在神经元表达的许多蛋白质[12]这表明此细胞和神经 元会有意外的关联，也可能具有更多神经元特性的转录因子而另一个可能的解 释是与神经细胞系相比，该细胞生长代谢速率更快，因而在转染后的相冋吋间内， 荧光素酶产量更多综上，本实验构建了含人DRD1基因启动子区的双荧光素酶报告基因系统， 通过转染人真核细胞HEK293验证了其具有较强的转录活性,为进一步研究DRD1 基因表达及转录调控机制提供了基础工具参考文献：[1] Grandy D K, Zhou Q Y, Allen L, et al. A human DI dopamine receptor gene islocated on chromosome 5 at q35.1 and identifies an EcoRI RFLP. Am J Hum Genet.1990; 47: 828-834.[2] KatoT. Molecular genetics of bipolar disorder and depression. Psychiatry ClinNeurosci. 2007; 61: 3-19.[3] Dollfus S, Campion D, Vasse T, et al. Association study between dopamine DI,D2, D3, and D4 receptor genes and schizophrenia defined by several diagnosticsystems. Biol Psychiatry. 1996; 40: 419-421.[4] Zhang C, Xie B, Du Y S, et al. [Gene-gene interaction between DNMT3B andDRDl in schizophrenia]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2010; 90: 3059-3062.[5] Howe A S, Leung T, Bani-Fatemi A, et al. Lack of association betweendopamine-beta hydroxylase gene and a history of suicide attempt in schizophrenia:comparison of molecular and statistical haplotype analyses. Psychiatr Genet. 2014;24: 110-115.[6] Del Zompo M, De Luca V, Severino G, et al. Haplotype association studybetween DRD1 gene and bipolar type I affective disorder in two samples fromCanada and Sardinia. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2007; 144B: 237-241.[7] Zhao L, Lin Y, Lao G, et al. Association study of dopamine receptor genespolymorphism with cognitive functions in bipolar I disorder patients. J Affect Disord.。