质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定.docx

实验三质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定一、 目的学习质粒的酶切及电泳分析二、 原理限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末 端，这样有利于DNA片段再连接限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段因此，鉴定 酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断 酶切片段大小的差别用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略 地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两 条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA :③ 线状DNA，双链DNA断开成线状电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其 次是线状DNA和开环DNA因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2〜3条区带三、 试剂与主要仪器（一）试剂1. EcoR I 酶2. 九 DNA3. TBE缓冲液（5x）：用时需稀释10倍4. 点样缓冲液Loading buffer （10x）： 0.25%溴酚蓝，40%甘油5. 溴乙啶（EB）： 10mg/ml溴乙啶注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。

6. 琼脂糖（二）仪器1. 电泳仪系统2.紫外灯 3.恒温水浴箱四、 操作步骤（一）质粒DNA酶切1 •按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号管号①②③质粒DNA101010EcoR I / 卩111酶切 Buffer (10x) / 卩1222ddHp 卩1876RNA酶12.加样后混匀，置于37°C水浴中，保温2小时然后每个管中加入4卩1 Loading buffer 二）琼脂糖凝胶电泳1. 琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5xTBE缓冲液中，加热熔解冷却 至65C时加入2卩1 EB,混匀2. 胶板制备将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并在一端插好梳子然后倒入熔好 的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入0.5x TBE 缓冲液），拔掉梳子注意：缓冲液要高出胶面2毫米3. 加样每个样品中加入1/10体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中，要避免 相互污染1-2 cm处时，停止电泳5.观察及照相将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下在紫外灯下观察结果，如果 有条件也可用凝胶成像系统照相。