实验9-叶绿体色素的提取分离及理化课件.ppt

叶绿体色素的提取、、分离及理化性质实验9-叶绿体色素的提取分离及理化叶绿素的背景知识介绍l叶绿素分子是由两部分组成的：核心部分是一个卟啉环(porphyrin ring)，其功能是光吸收；另一部分是一个很长的脂肪烃侧链，称为叶绿醇(phytol)，叶绿素用这种侧链插入到类囊体膜与含铁的血红素基团不同的是，叶绿素卟啉环中含有一个镁原子叶绿素分子通过卟啉环中单键和双键的改变来吸收可见光各种叶绿素之间的结构差别很小如叶绿素a和b仅在吡咯环Ⅱ上的附加基团上有差异：前者是甲基，后者是甲醛基实验9-叶绿体色素的提取分离及理化l高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a 和叶绿素b 两种它们不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等叶绿素a分子式：C55H72O5N4Mg；叶绿素b分子式：C55H70O6N4Mg在颜色上，叶绿素a 呈蓝绿色，而叶绿素b 呈黄绿色按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所酯化实验9-叶绿体色素的提取分离及理化l叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾巴”镁原子居于卟啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。

叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性叶绿素不参与氢的传递或氢的氧化还原，而仅以电子传递（即电子得失引起的氧化还原）及共轭传递（直接能量传递）的方式参与能量的传递实验9-叶绿体色素的提取分离及理化l卟啉环中的镁原子可被氢离子、铜离子、锌离子所置换用酸处理叶片，氢离子易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本 叶绿醇是亲脂的脂肪族链，由于它的存在而决定了叶绿素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有机溶剂中由于在结构上的差别，叶绿素a呈蓝绿色，b呈黄绿色在光下易被氧化而退色实验9-叶绿体色素的提取分离及理化l叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素叶绿素溶液能进行部分类似光合作用的反应，在光下使某些化合物氧化或还原人工制备的叶绿素膜在光下能产生光电位和光电流，也能催化某些氧化还原反应实验9-叶绿体色素的提取分离及理化叶绿素的用途l造血功能l诺贝尔得奖人Dr.Richard Willstatter和Dr.Hans Fisher发现：叶绿素的分子与人体的红血球分子在结构上很是相似，唯一的分别就是各自的核心为镁原子与铁原子。

因此，饮用叶绿素对产妇与因意外失血者会有很大的帮助l帮助解除体内杀虫剂与药物残渣l营养学家Bernard Jensen博士指出，叶绿素能除去杀虫剂与药物残渣的毒素，并能与辐射性物质结合而将之排出体外此外，他也发现一般上健康的人会比病患者拥有较高的血球计数，但通过吸收大量的叶绿素之后，病患者的血球计数就会增加，健康状况也会有所改善实验9-叶绿体色素的提取分离及理化2. 类胡萝卜素l类胡萝卜素（carotenoid）是一类由八个异戊二烯单位组成的，含有40个碳原子的化合物，不溶于水而溶于有机溶剂叶绿体中的类胡萝卜素含有两种色素，即胡萝卜素（carotene）和叶黄素(lutein)，前者呈橙黄色，后者呈黄色胡萝卜素是不饱和的碳氢化合物，分子式是C40H56，有α、β、γ三种同分异构体在一些真核藻类中还含有ε－类胡萝卜素叶子中常见的是β-胡萝卜素，它在动物体内水解后即转变为维生素A叶黄素是由胡萝卜素衍生的醇类，分子式是C40H56O2 实验9-叶绿体色素的提取分离及理化l一般情况下，叶片中叶绿素与类胡萝卜素的比值约为3:1，所以正常的叶子呈现绿色秋天，叶片中的叶绿素较易降解，数量减少，而类胡萝卜素比较稳定，所以叶片呈现黄色。

l全部的叶绿素和类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，并以非共价键与蛋白质结合在一起，组成色素蛋白复合体（pigment protein complex），各色素分子在蛋白质中按一定的规律排列和取向，以便于吸收和传递光能实验9-叶绿体色素的提取分离及理化 一一. 实验原理实验原理 1.1 叶绿素：叶绿素： 主要包括叶绿素主要包括叶绿素a和和bl分子式: Chla C55H72O5N4Mg Chlb C55H70O6N4Mgl结构式: 卟啉环化合物 四个吡咯环与四个=CH-组成一个大环,共轭双键形成一个大π键,环中央有一个镁原子,卟啉环决定叶绿素颜色,也是吸收可见光,并以诱导共振方式传递光能的根本所在,叶醇尾是由四个异戊二烯单位组成的双萜 Chla 蓝绿色 Chlb 黄绿色l 脂溶性: 难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、已醚、已烷等有机溶剂 卟啉环头部呈极性, 具亲水性; 叶醇尾部具亲脂性 实验9-叶绿体色素的提取分离及理化实验9-叶绿体色素的提取分离及理化l皂化反应: Chla、Chlb 是双羧酸的酯 一个羧基被甲基酯化 可发生皂化反应 另一个羧基被叶醇基酯化 COOCH3 C32H30ON4Mg +2KOH COOC20H39 COOK C32H30ON4Mg +CH3OH+C20H39OH COOK l取代反应：卟啉环中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2+取代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色实验9-叶绿体色素的提取分离及理化•光学特性：（1）吸收光谱：色素溶液随波长改变而发生光吸收变化的图谱 Chla Chlb的吸收光谱有二个强吸收峰 640——660nm 红光部分 叶绿素特有 410——470nm 蓝紫光部分 卟啉环化合物共有 （2）荧光和磷光 荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。

强度大，寿命短（10-9秒） 磷光： Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内放出暗红色的光 寿命长（10-2秒——10-3秒） 实验9-叶绿体色素的提取分离及理化实验9-叶绿体色素的提取分离及理化实验9-叶绿体色素的提取分离及理化1.2 类胡萝卜素类胡萝卜素 胡萝卜素 橙黄色 不溶于水 叶黄素 鲜黄色 溶于有机溶剂l分子式、结构式： 胡萝卜素：C40H56 有α、β、γ三种同分异构体 叶黄素是胡萝卜素的衍生物，其两端的紫罗兰酮环第四位C上的H被OH取代，分子式为C40H56O2 l类胡萝卜素吸收光谱都在蓝紫光部分，所吸收的光能传递给叶绿素用于光合作用，保护叶绿素分子不被氧化或阳光破坏 实验9-叶绿体色素的提取分离及理化实验9-叶绿体色素的提取分离及理化二. 试剂与材料2.1 实验试剂：实验试剂： 石油醚（沸程60℃∽90℃）、丙酮、甲醇、氢氧化钾、石英砂、碳酸镁、氯化钠、醋酸铜。

2.2 仪器和器皿仪器和器皿： 分光光度计、台秤、剪刀、 研钵、移液管、漏斗、大试管、层析缸 2.3 材料：材料： 新鲜菠菜叶片，不同颜色的花和果实实验9-叶绿体色素的提取分离及理化三三. .实验操作实验操作 丙酮研磨提取叶绿素 ↓过滤、洗研钵及残渣 ↓ ↓2mL丙酮提取液 余下的色素提取液用石油醚萃取 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 加入6N HCl 纸层析 荧光 皂化反应 光破坏 （脱镁叶绿素） ↓ ↓ 分离色素 Cu取代 实验9-叶绿体色素的提取分离及理化四四. 实验内容实验内容4.1 叶绿素的荧光现象观察： 取叶绿体色素提取液少许于1支试管中，用反射光和透射光观察提取液的颜色有何不同，反射光下观察到的提取液颜色即为叶绿素产生的荧光颜色左：透射光下右：反射光下实验9-叶绿体色素的提取分离及理化4.2 4.2 皂化作用皂化作用 在观察过荧光现象的色素提取液中加入在观察过荧光现象的色素提取液中加入1ml 20%KOH-1ml 20%KOH-甲醇溶甲醇溶液，充分摇匀，静置片刻，再加入液，充分摇匀，静置片刻，再加入5ml5ml苯苯, ,混匀，然后用滴管混匀，然后用滴管沿着管壁缓缓加入沿着管壁缓缓加入1ml1ml蒸馏水。

静置片刻，溶液慢慢分为三蒸馏水静置片刻，溶液慢慢分为三层：上层为苯，其中的色素为类胡萝卜素和叶黄素；下层为层：上层为苯，其中的色素为类胡萝卜素和叶黄素；下层为乙醇溶液，其中的色素为已经皂化的叶绿素乙醇溶液，其中的色素为已经皂化的叶绿素a a、、b b素和少量叶素和少量叶黄素；试管底部同时出现白色沉淀另取黄素；试管底部同时出现白色沉淀另取4ml4ml色素提取液做色素提取液做对照，其他步骤都一样，只是不加对照，其他步骤都一样，只是不加KOH-KOH-甲醇溶液甲醇溶液实验9-叶绿体色素的提取分离及理化4.3 4.3 叶绿体色素的理化性质叶绿体色素的理化性质氢和铜对叶绿素中镁的替代作用氢和铜对叶绿素中镁的替代作用 取取4ml4ml色素提取液于试管中色素提取液于试管中, ,加入数滴加入数滴5%5%盐盐酸，慢慢摇动，可见逐渐由绿色变为褐色酸，慢慢摇动，可见逐渐由绿色变为褐色叶叶绿素中的镁被盐酸中的氢替代，变成了去镁叶绿素中的镁被盐酸中的氢替代，变成了去镁叶绿素 取一半上述变成了去镁叶绿素溶液，加入取一半上述变成了去镁叶绿素溶液，加入少许醋酸铜结晶，缓慢加热，这时，去镁叶绿少许醋酸铜结晶，缓慢加热，这时，去镁叶绿素中的氢又被铜取代。

铜代叶绿素为何种颜色素中的氢又被铜取代铜代叶绿素为何种颜色？？实验9-叶绿体色素的提取分离及理化五. 结果与分析l对实验现象作好详细记录， 并加以解释l请对皂化反应现象做出合理解释，而不是单单用反应方程式来表示实验9-叶绿体色素的提取分离及理化六六. 注意事项注意事项l实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要远离火源l研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研磨时四处飞溅l过滤时不要使用滤纸而使用棉花，棉花塞在漏斗基部要松紧适当l叶绿素要避光保存实验9-叶绿体色素的提取分离及理化七. 思考题1 、在本实验中加入少许二氧化硅和碳酸钙的目的各是什么? 2、荧光现象是叶绿体色素的光化学性质之一，但为什么荧光现象的产生只在色素提取液中可以看见，而在植物绿色叶片中很难看到荧光产生？3、H+和 Cu2+ 对叶绿素分子中Mg2+的取代作用有何实用价值?实验9-叶绿体色素的提取分离及理化l4 、通常在提取叶绿体色素时都使用含有一定比例水分的有机溶剂（95%乙醇或80%丙酮），为什么不能使用无水乙醇或丙酮？实验9-叶绿体色素的提取分离及理化。