推荐4第四章基因克隆的载体4噬菌粒载体.ppt

第四节第四节 噬菌粒载体噬菌粒载体1噬菌粒载体噬菌粒载体 由由质粒质粒载体和载体和单链噬菌体单链噬菌体载体结合而成的载体结合而成的新型的载体系列新型的载体系列 DNA长约长约3 kb，可携带约，可携带约10 kb的外源的外源基因 它具有它具有质粒的复制起点质粒的复制起点、选择性标、选择性标记、多克隆位点等，方便记、多克隆位点等，方便DNADNA的操作，可在细的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在点，在辅助噬菌体辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体2常用的噬菌粒载体常用的噬菌粒载体pUC118pUC118和和pUC119pUC119是一对分别由是一对分别由pUC18pUC18和和pUC19pUC19质粒质粒与野生型与野生型M13M13噬菌体噬菌体的基的基因间隔区（因间隔区（IGIG）重组而成的噬菌粒载体重组而成的噬菌粒载体 1. 1. 具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNADNA，，可克隆可克隆10kb10kb的外源的外源DNADNA片段，并片段，并易于进行分离易于进行分离与操作；与操作； 2. 2. 编码一个编码一个ampampr r基因作为选择记号，因此只有携带基因作为选择记号，因此只有携带pUC118pUC118或或pUC119pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的便于转化子的选择选择；； 3. 3. 拷贝数含量高拷贝数含量高，每个寄主可高达，每个寄主可高达500500个，所以只要用个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNADNA；； 34. 4. 存在着一个存在着一个多克隆位点多克隆位点区，因此许多种不同类型的区，因此许多种不同类型的外源外源DNADNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； 5. 5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZlacZ基因基因的的5’-5’-端编码区，可按照端编码区，可按照IPTGIPTG组织化学显色反组织化学显色反应试验，筛选重组子；应试验，筛选重组子；6. lacZ6. lacZ基因是置于基因是置于laclac启动子的控制之下，这样启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以插入的外源基因便会以融合蛋白质融合蛋白质的形式表达；的形式表达；7. 7. 含有含有质粒的复制起点质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，规的方式，复制复制形成大量的双链形成大量的双链DNADNA分子分子48. 8. 带有一个带有一个M13M13噬菌体的复制起点噬菌体的复制起点，在有，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链成出单链DNADNA拷贝，并包装成噬菌体颗分拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；泌到培养基中； 9. 9. 在在pUC118pUC118和和pUC119pUC119这两个载体中，多克这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的因的正链正链DNADNA，另一个则可转录出，另一个则可转录出负链负链DNADNA；；10. 10. 可以直接对克隆的可以直接对克隆的DNADNA片断进行核苷酸片断进行核苷酸的的序列测定序列测定，免去了从质粒载体到噬菌，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。

体的这一烦琐的亚克隆步骤56pBluescriptpBluescript噬菌粒载体噬菌粒载体基本结构：基本结构： 1. 1. 在多克隆位点的两侧，有一对在多克隆位点的两侧，有一对T3T3和和T7T7噬菌噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；动； 2. 2. 同时具有一个单链噬菌体同时具有一个单链噬菌体M13M13或或f1f1的复制的复制起点和一个来自起点和一个来自ColE1ColE1质粒的复制起点，在不质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的合成单链或双链的DNADNA；； 3. 3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号；化子记号； 4. 4.含有含有lacZlacZ基因，可用基因，可用Xgal-IPTGXgal-IPTG组织显色反组织显色反应法筛选噬菌粒载体应法筛选噬菌粒载体7T7T3用于体外转录用于体外转录89。