代谢工程与合成生物学作业生物元件试卷教案.doc

合成生物学之生物部件622（山东大学生命科学学院，济南,25０10０)摘要：合成生物学强调“设计”和“重设计”,其目的是通过人工设计和构建自然界中不存在的生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问题，其工程化的思想和标准化的工具一经兴起变得到全世界范围的广泛关注生物系统的层次化结构是合成生物学本质化的典型体现，合成生物学系统中最简单最基本生物模块被称为生物部件(pａrt),它是自下而上的研究策略中基础部分，本文回顾了合成生物学中常用的生物部件级标准化使用方法，着重介绍了启动子和核糖开关的相关研究进展关键词:合成生物学生物部件生物元件19５3年,年轻的J．D．Wａｔｓon和F. Cｒiｃk从ＤＮA的X射线的Ｘ衍射图上解读了双螺旋结构，隐藏了几十亿年的生物密码逐渐露出端倪2０03年人类基因组计划顺利完成,此后包括人类在内的各种生物的图谱纷纷出炉，生物遗传密码的神秘面纱正在被迅速揭开生物学由定性描述转向定量计算，从分析到设计,进入系统和合成生物学（ｓynthｅtｉc bioｌogy)的的时代目前合成生物学的定义还处于多元化阶段,比较全面地可以概括为：合成生物学是指按照一定的规律和现有的知识，设计和建造新的生物部件、装置和系统，或重新设计已有的天然系统为人类的特殊目的服务。

从这个定义来看，合成生物学包含自下而上的研究策略和自上而下的研究策略,对于前者的探索是艰深而富有划时代意义的合成生物学最终期望是借鉴电子学的方法能能像“搭积木”一样构建基因线路，而这最基本的就是模块化元件我们称具有标准接口、功能相对独立生物大分子、信号转导路径、基因线路等为“模块”(ｍoｄｕle）或生物积块(BioBrｉck）,模块的规模可大可小，大致可分为部件（ｐａｒt）、装置（ｄｅvｉce）、系统（Sｙsｔeｍ)及多细胞体系等几个层次,其中最基础的就是生物部件模块化设计体现了合成生物学的精髓,模块往往具有信息隐藏，内聚耦合，封闭性开放性的特性常见的生物部件按照功能可以分为启动子（promoter）、核开关(Riboswithch)、RBＳ、终止子、操纵子、蛋白编码基因（CDS)、报告基因、标签组件、操纵子等，当然这些分类层侧不是绝对的1. 启动子1.1 启动子的结构启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DＮA序列，在原核生物和真核生物中是有差别的1．1．1 原核生物中的启动子原核生物中的启动子通常，RNA聚合酶是依靠б因子识别ＤＮA上的特定序列,б７０是发现比较早也是比较常见的б因子，它通常特异识别启动子的-１0和-3５两个保守DＮA盒子（如Error! Reference source not found.）。

图1原核生物中的启动子模式图1.1.2真核生物中启动子结构相比原核生物的启动子，真核生物的启动子比较复杂,ＲNA聚合酶Ⅱ核心启动子是一个在转录过程中关键的但又容易被忽略的元件核心启动子被定义为DNA的延伸,它涵盖了RNA的起始位点,典型的核心启动子大约有４0到50核苷酸的长度,它指导基因转录的起始在过去,人们推测核心启动子在功能上是通用的，转录起始是通过一种共享通用的机制进行的最近的研究表明,各种核心启动子在结构和功能上都存在相当多的差异存在大量的DNA元件作用于核心启动子的活性，给定核心启动子的特定性能是由这些核心启动子修饰因子的有无决定的已知的核心启动子元件包括TATA盒子、Iｎr（起始子)、BREu｛ATA盒子的上游的BＲE [TFⅡB(RＮAⅡ聚合酶的转录因子）识别元件］}和BRＥd(TATA盒子下游的BRE)、MTE（十基序元件)、ＤＣE(下游核心元件）和DPE(下游核心启动子元件)(如Error! Reference source not found.)图2真核生物中启动子模式图1.2启动子的种类在合成生物学以及以前的生物学研究中，我们已经标准化了许多启动子元件（如Error! Reference source not found.）。

最经典的启动子是乳糖操纵子中的乳糖启动子，它可以被乳糖诱导,实验中我们常用IPTG诱导；色氨酸启动子引人注意的特性是有一段弱化子，可以根据细胞环境中色氨酸的浓度调控后续基因的表达;ｔaｃ启动子则是上述两种启动子的融合启动子,是典型常用的强启动子；Pl、Pr是噬菌体溶源和裂解生长状态转化及维持中的重要启动子，阻遏蛋白的温度敏感突变可以使其收温度诱导；PｔetA基因也是很常用启动子之一,可以被脱水四环素诱导;Ｔ7启动子则是比较特殊一种启动子，对RNA聚合酶的种类有特异性表格Error! Bookmark not defined.常见启动子的概述启动子名称英文表示调节基因诱导物备注乳糖启动子ＰlacZlaｃI异丙基硫代半乳糖苷(IＰTG）可诱导负反馈色氨酸启动子PtｒpｔrpR - ｔrp可阻遏负反馈(！弱化子)tａｃ启动子PtaclａcIqIPTG、乳糖、温度敏感拼合启动子启动子Pl、PrPl/PｒcIts８57温度敏感可诱导负反馈四环素溢出泵基因启动子PteｔAtｅｔR蛋白家族四环素(Ｔc）脱水四环素（aTc)可诱导负反馈Ｔ7启动子Pt7 大肠杆菌的RNＡ聚合酶不能识别,但噬菌体及真核生物的RNA聚合酶可以1．3启动子的调控及意义为实现一些特定目的,微生物系统工程需要一些设计工具，这些工具以某种可预测的、定量的方式起作用。

在合成生物学的领域，基因之间级联调控很多都是发生在转录水平（如Error! Reference source not found.），而这些往往是在转录起始阶段起作用，也就是说与启动子有关，因此标准化设计启动子对整个系统的运转有重要意义图Error! Bookmark not defined.在转录水平控制基因表达的设计工具在自下而上的研究策略中，我们往往用基因线路模拟一些电子学上的逻辑开关,从简单逻辑或与非，到双稳态开关,再到震荡子(如图 4）实质上都是上面提到的启动子及其调控基因按照一定次序设计排列的结果此外,在合成生物学学术比赛iGEM中，相当多的队伍作品的关键都是发现或者标准化了一些有特殊功能启动子及其相关组件,比如感光、温度敏感、感受重金属离子等图3双稳态开关（左)及震荡子(右)的逻辑结构2.核糖开关在19９１年，人们就发现E.coli的ｂtｕＢ基因转录产物5’-ＵＴR存在高度保守序列,并发现Aｄo-cbl和B1２可以使ｂtnB基因表达,但没有发现可以与Ado-cbl结合的蛋白因子;199０年，Andrew从随即合成的RNA序列中筛选出特异性结合有机染料配体的RＮA,并命名为“apｔaｍｅr”（适体);2０02年，Breaker受到适体的启发，证明了这种天然适体的存在,命名为“核糖开关”。

到目前(200９年）为至已经发现了不少于　12 个核糖开关(如Error! Reference source not found.Error! Reference source not found.),大部分是抑制性的（当存在相应代谢物时基因关闭)主要参与氨基酸、核苷酸、维生素等基础物质的代谢表格1一些已知的Ｒiboｓwiｔhｃh的名称、调节小分子和功能核糖开关中，mRNA 本身作为传感器 ,直接感受环境中相应代谢物的变化 ,结合代谢物后发生构象变化 ,在转录和翻译水平调节基因的表达核糖开关也是一种反馈调节机制 ，与以往发现的调节机制的区别是:它不需要任何蛋白质（乳糖操纵子）或核糖体(色氨酸弱化子）作为中介 ,由 ＲNA 直接感受环境中代谢物的变化　,通过形成选择性茎环结构 ,在转录延伸和翻译起始水平调节基因表达2.1核糖开关的作用机制已发现的细菌核糖开关均位于代谢相关基因mRNA的 5′ＵTＲ，由 2 个结构域组成 :适体结构域（ａpｔameｒ domaｉn,AD）　和表达结构域 （ expｒessiｏn doｍain, EPＤ)ＡD 直接结合小分子代谢物,是RNA　传感器. 序列分析表明，在不同细菌的同类核糖开关中,AD 序列保守，形成高度相似的二级结构。

与配体结合后,AD 发生构象变化,信息传递至 EPD ,后者通过形成选择性茎环结构，直接调节基因的表达不同核糖开关的 EPD 可能利用不同的机制调节基因表达如Error! Reference source not found.)目前发现的真核生物的核糖开关位于 3′UＴR 或内含子，也具有相似的　AD 和 ＥPＤ,可能在多个环节调节真核生物基因表达图4核糖开关的作用机制为研究核糖开关的作用机制，F．Ｊ.Isａacs等构建了人工的Ribｏswithｃh（如Error! Reference source not found.），这种转录后调控比转录水平的调控更加迅速基因正常表达时,启动子P控制gfp的表达转录形成的mＲNＡ的RＢS暴露在外,一旦核糖体识别并与之结合以后，mＲNA既可以翻译成蛋白质而在人工构建Riboｓwiｔｈch中,在启动子Pcr和ＲBS中间插入一段与RBＳ互补的cr序列转录后mRNA5’与RＢS结合形成发卡结构，将ＲＢS掩盖阻止核糖体与之结合，从而组织翻译的进行另一个启动子Pta启动后表达一个短链非编码ＲNＡ——taRNAtａＲNA能以高度特异性优先定位于cｒRＮA,共经过线性-环相互作用将crRNＡ的发卡环解开，taＲＮA的尾部与cｒRNA互补配对。

此时,crRNA的ＲBS位点暴露在外,核糖体可与之结合重新激活翻译2.２核糖开关的应用２．2.1小分子抗菌药物ｒiboｓｗitch在人类细菌性病原体内分布广泛(如）,预示着将rｉboｓwｉtch作为药靶将会有广阔的应用前景临床上一些常用抗菌药物的毒性机制已经被证实是以rｉｂｏswiｔch为药靶的.例如吡啶磺胺(pyrithｉamiｎｅ，ＰT)，一种常用的硫胺代谢对抗物,是维生素B１ （Ｔhiaminｅ ,硫胺素)的类似物它在细胞内很容易磷酸化成吡啶磺胺焦磷酸盐PTPP)PTPP　可以与许多TPP ｒiboswiｔcｈ结合（其亲和性与TPＰ 类似)，从而抑制由ＴPＰ riboswitch控制的基因表达图Error! Bookmark not defined.用于控制转录后基因调控的人工Ribosｗithcｈ系统表格2一些含有Riboswｉthcｈ调控的人类细菌性病原体2．2.2细菌趋向运动细菌的趋向运动的研究在生物降解、生物纳米、合成生物学等领域具有重要意义Sｈａnａ Ｔopp等人在大肠杆菌中设计一个通过小分子和mＲNA来指导细菌运动的系统在野生型的大肠杆菌中,鞭毛马达的旋转方向有蛋白ChｅY控制，当CheY没有被磷酸化时，鞭毛马达逆时针旋转；当ChｅY被磷酸化后，ChｅY-P可以和鞭毛马达蛋白FliM结合，导致细胞滚动；因此野生型大肠杆菌可以在半固体琼脂上迁移。

然而，在CｈeＺ蛋白缺失时,ＣｈeY-P不能去磷酸化,细胞只能翻滚不能迁移如Error! Reference source not found.)研究人员在CｈeZ蛋白的编码基因前设计了核糖开关(如Error! Reference source not found.左），它只有和茶碱结合后才能改变构型与核糖体结合翻译出ＣhｅZ使细胞运动所以导致了改造后的大肠杆菌只会在有茶碱存在的区域迁移(如Error! Reference source not found.右）图Error! Bookmark not defined.大肠杆菌CｈeＹ与其运动的关系图5Riboｓwiｔhｃh设计(左）与实验结果（右)。