植物RNA的分离纯化LiCl沉淀法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,实验三,植物RNA的分离纯化(,LiCl沉淀法),一、实验原理,,,总RNA包括线粒体RNA、叶绿体RNA、tRNA和mRNA与DNA一,,样，RNA在细胞中也是以与蛋白质结合的状态存在RNA分子主,,要存在于细胞质中，约占75%，另有10%存在于细胞核内，15%,,在细胞器中RNA以rRNA的数量最多(80-85%)，tRNA 及核内小,,分子RNA占10%-15%，而mRNA 分子只占1%-5%mRNA 分子大小,,不一，序列各异RNA提取一般使用蛋白质强变性剂有效抑制RNA酶活性，同,,时并使DNA变性，再通过有机溶剂反复抽提去掉蛋白质、多糖,,等物质，在RNA沉淀剂的作用下，针对性分离出RNA总RNA提取原则：① 保持核酸结构的完整性；② 排除其,,它分子的污染1,,二、仪器设备,,高速冷冻离心机、电子天平、冰箱,,三、材料及试剂,,1.材料：植物任何部分的新鲜组织,,2.试剂：,,① 水饱和酚(pH4.9)；,,② 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合溶液；,,③ 3mol/L NaAc(pH 5.2)；,,④ RNA提取缓冲液：内含0.2mol/L Tris-HCl(pH,,8.0)、0.4mol/L LiCl、25mmol/L EDTA和1%SDS；,,⑤ 2mol/L LiCl；,,⑥ 75％乙醇；,2,,⑦ 无水乙醇；,,⑧ 灭菌双蒸水(ddH,2,O，无Rnase)；,,⑨ 氯仿。

四、操作步骤,,1．取取植物材料0.5g，放入预冷的研钵中，加入0.1ml,,-巯基,,乙醇 2．液氮中充分研磨，中间可补充液氮，直到将材料磨成粉末3．将粉末迅速分装到3-5个1.5ml离心管中，分别加入0.6ml提,,取液，剧烈振荡2-3min4．分别加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，振荡1min，冰,,上放置5min5．4℃、12000g离心10min6．将上层水相转到对应的灭菌离心管中，加入等体积的苯酚:,,氯仿:异戊醇 混合液，振荡混匀，室温下、12000g 离心,,5min3,,7．重复步骤6，直至无白色界面物质8．将水相转至对应的灭菌离心管中，加入等体积氯仿振荡混,,匀，以除去痕 量的苯酚9．室温下、12000g离心5min10．将上层水相转移至对应的灭菌离心管中，加入1/10体积的,,NaAc(3mol/L, pH 5.2) 和2倍体积的无水乙醇，混匀，-70℃,,放置30min11．4℃、12000g离心20min12．弃去上清夜，向沉淀加入0.3ml LiCl(2mol/L)，并振荡溶,,解，冰上静置 10－30min4℃、12000g离心20min。

13．弃去上清液，加入0.3ml灭菌双蒸水(ddH2O，无RNase)，,,振荡使沉淀溶解14．加入1/10体积的NaAc(3mol/L, pH 5.2) 和2倍体积的无水乙,,醇，混匀，-70℃放置30min15．4℃、12000g离心20min4,,16．弃去上清液，沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇1ml洗涤，并,,短暂离心17．小心吸去残留的乙醇，空气中凉干3min18．RNA用20-30,,l无菌水溶解，贮藏于-70℃备用19．RNA的浓度测定和纯度分析,,取2-5,,lRNA溶液稀释至100,,l，于紫外核酸蛋白检测仪上测,,定A260、A280和A320的OD值，并计算RNA浓度和得率注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm，对纯的RNA来,,说，OD260／OD280为2.0，1个OD260约为40,,g/ml RNA20．RNA的完整性检测,,1.2%琼脂糖凝胶电泳,,在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带：,,28S、18S、和5S rRNA其中28S rRNA条带的亮度应该为18S,5,,rRNA条带的1.5-2倍反之，说明部分28S rRNA已经降解成18S rRNA。

若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解；若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA污染6,,【注意事项】,,1．条件允许的实验室应专门辟出RNA操作区，离心机、移液,,器、试剂等均应专用，RNA操作区应保持清洁，并定期行除,,菌2．操作过程中应始终戴一次性手套，并经常更换，以防止手、,,臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染,,用具3．避免在操作过程中说话聊天4．配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶5．所有旧塑料制品都必须用0.5mol/L的NaOH处理10min，用,,双蒸水彻底冲洗，DEPC-H,2,0浸泡过夜后灭菌6．所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下烘烤6h或更,,长时间7．配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC在37℃处理12h以上，,,然后用高压灭菌除去残留的DEPC不能高压灭菌的试剂，应当,,用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除,,菌7,,8. 无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可,,以消除RNA酶的活性但氯仿会溶解某些塑料制品，应当注,,意9．有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，,,乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1%,,DEPC水冲洗，晾干。

10. DEPC有致癌的潜在嫌疑，操作时要小心仔细，一定要戴,,上手套，并且最好在通风橱中进行11．RNase AwayTM试剂可以替代DEPC，操作简单，价格,,低，且无毒性只需将RNase AwayTM直接倒在玻璃器皿和塑,,料器皿的表面，浸泡后用水冲洗去除，即可以快速去除器皿表,,面的RNase，并且不会残留而干扰后继实验12．如果提取的RNA样品暂时不用，最好置于-70℃低温冰箱,,中保存，再次使用时应做RNA琼脂糖变性胶电泳分析，以检测,,RNA的完整性8,,【常用的RNA酶抑制剂】,,1. 焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制,,剂它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质,,变性，从而抑制酶的活性2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂,,解组织的同时也使RNA酶失活它既可破坏细胞结构使核酸从,,核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，,,它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的,,活性4. RNA酶的蛋白抑制剂(Rnasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得,,来的酸性糖蛋白。

RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可,,以和多种RNA酶结合，使其失活5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。