RNAi、miRNA及siRNA的区别和联系.doc

用 siRNA 进行 transient transfection 不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几 天(1 — 3)后要立刻抽提蛋白，进行分析用质粒中的 shRNA 进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细 胞株系，但需要时间较长用病毒中的 shRNA 进行感染( infection) ，抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系瞬时 RNAi 短时转染是一种常见的简单生物手段， 这种手段能够将外源性的 siRNA 或是能够编码 siRNA 的质粒通过非病毒感染的方式导入细胞中转染的细胞通常在细胞质膜表面有一个短时小 孔或者一个“洞”，这些特殊的孔结够能够让基因物质通过细胞膜进入细胞质中转染过 程中可以借助磷酸钙与形成极小的磷酸钙复合物沉淀黏附在细胞膜表面，而借助内吞作用 加速基因物质进入细胞质或者也可以通过借助带正电荷的阳离子脂质体形成脂质体包含 物体，然后经过内吞作用进入细胞质中 . 不过上述的这些转染技术所产生的沉默作用持续时间较短，因为所诱导的 siRNA 不能够进行自身复制而且会因为细胞的分化而被稀释或降解转染的外源 DNA 由于不能够插入核内基因组通常会在细胞经历有丝分裂过程中丢失。

一旦所转染的细胞中 siRNA 消失后，靶基因功能又重新恢复到转染前水平采用转染技术来产生基因沉默通常要在48-72小时 才能达到高沉默率，而且根据不同转染效率也只能维持2 4 - 9 6小时因此， siRNA转染可作为短期分析基因功能的有效工具，而且可以方便快速去验证针对靶基因所设的 siRNA干扰效率当前，由于 siRNA 转染技术易于制备、随时可用以及很短的操作时间等特点主 要用于短时基因沉默长久 RNAi由于表型改变通常和基因型改变在时间上不同步，许多分析试验就要求长时间对靶基因的 沉默 siRNA 转染直接产生的沉默由于其短时性就不能用于长时间的实验研究，人工合成 siRNA 的转染手段由于其不稳定性和低转染效率不能广泛运用于其他类型细胞 使用载体质粒手段也同样受细胞系限制，比如原代细胞就不能转染其用做长期培养研究长时期的基因沉默就特别需要发展一类长期稳定的细胞系，这就要求所转染的外源基因能 够长期留在宿主细胞基因组中或者其子代细胞细基因组中 . 病毒介导 siRNA 载体其病毒高感染效率特点对于原代细胞和其它难转染细胞是一种很好的 选择为了准确地测定 siRNA 对细胞靶基因的沉默效率，就必须能够转染更多的细胞。

否 则，如果转染细胞的数量不够的时候，那么在使用 RT-PCR或Western analysis 进行分析的时候，背景条件中的非转染细胞就会干扰我们对转染细胞的分析结果 目前，有下面几种表达传递发卡 siRNA 病毒载体，包括： 1. 逆转录病毒载体 , 这是一种比 较好用的载体，它能够将 siRNA 表达框整合到分化的细胞基因组中并能够通过在抗生素选 择条件下维持稳定长期的 hsRNA表达2•慢病毒载体，这种载体扩大了宿主细胞的种类包括一些未分化的细胞和分化末期细胞，通过扩增，转导成功的细胞基因组中将会永远包含shRNA表达框，并能够稳定表达 shRNA产生持久的基因沉默的效果 3.腺病毒载体，这也是一种常见的分整合病毒，它能够感染分化和未分化的细胞，但只能在细胞中以一种游离体的形式存在优点缺点短暂转染方便快捷不可再生，短期稳定转染稳定性，永久性滞后性，致死性可诱导 RNA 干扰可逆调控耗时RNA、miRNA及 siRNA的区别和联系RNA干扰 （RNAi）：近年来的研究表明，将与 mRNA对应的正义RNA和反义 RNA 组成的双链 RNA（dsRNA） 导入细胞， 可以使 mRNA 发生特异性的降解， 导 致其相应的基因沉默。

这种转录后基因沉默机制 （post-transcriptional gene silencing, PTGS） 被称为 RNA 干扰（ RNAi ）MicroRNA（ miRNA,微RNA）:即为长度为22nt左右的5端带磷酸基团、3'端 带羟基的非蛋白编码的调控小 RNA 家族小干涉 RNA（ siRNA ） :是在 RNA 干涉过程中人工体外合成的小片段 RNA， 由约 20 个碱基对组成，包括 5 个磷酸盐， 2 个核苷和 3 个悬臂miRNA与 siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右2.二者 都依赖 Dicer 酶的加工，是 Dicer 的产物，所以具有 Dicer 产物的特点 3.二者 生成都需要 Argonaute 家族蛋白存在 4.二者都是 RISC 组分，所以其功能界限 变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠 5.miRNA 和 siRNA 合成都是由 双链的 RNA 或 RNA 前体形成的miRNA与 siRNA的不同点：1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因 素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产 物。

2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA3.Dicer酶对二者 的加工过程不同， miRNA 是不对称加工， miRNA 仅是剪切 pre-miRNA 的一个 侧臂，其他部分降解；而 siRNA 对称地来源于双链 RNA 的前体的两侧臂 4. 在作用位置上， miRNA 主要作用于靶标基因 3'-UTR 区，而 siRNA 可作用于 mRNA 的任何部位 5 .在作用方式上， miRNA 可抑制靶标基因的翻译，也可以 导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而 siRNA 只能导致靶 标基因的降解，即为转录水平后调控 6.miRNA 主要在发育过程中起作用，调 节内源基因表达，而 siRNA 不参与生物生长，是 RNAi 的产物，原始作用是抑 制转座子活性和病毒感染。