第十八章支原体.ppt

第十八章支原体、 衣原体、立克次体 第一节支原体n是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形性，能通过除菌滤器，在无生命培养基性，能通过除菌滤器，在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物由于它们能形成有分支的长丝，故称之由于它们能形成有分支的长丝，故称之为支原体为支原体  支原体科分支原体属和脲原体属两个属对支原体科分支原体属和脲原体属两个属对人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体除此之外，支原体还经常污染细胞培养，给除此之外，支原体还经常污染细胞培养，给实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带来一定困难来一定困难一、肺炎支原体一、肺炎支原体n感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统,借借滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称Pl蛋白。

蛋白n是青少年急性呼吸道感染的主要病原体，表是青少年急性呼吸道感染的主要病原体，表现为上呼吸道感染综合征，占非细菌性肺炎现为上呼吸道感染综合征，占非细菌性肺炎的的1 1／／3 3以上过去认为是温和的病原体，现以上过去认为是温和的病原体，现在认为它也可引起严重的双侧肺炎和其他系在认为它也可引起严重的双侧肺炎和其他系统的肺外并发症，如心肌炎、心包炎、免疫统的肺外并发症，如心肌炎、心包炎、免疫性溶血性贫血、肾炎等性溶血性贫血、肾炎等 微生物特性微生物特性1．．形形态态与与结结构构 类类似似酒酒瓶瓶状状，，没没有有细细胞胞壁壁，，仅仅有有细细胞胞膜膜G-易易着着色色，，Giemsa染染色色呈呈淡淡紫紫色色细细胞胞膜膜中中胆胆固固醇醇含含量量多多所所有有肺肺炎炎2株株共共同同具具有有P1蛋蛋白白，，是是主主要要特特异异性性免免疫疫原原和血清学诊断的主要抗原和血清学诊断的主要抗原  2.抗原结构抗原结构 来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是主要抗原，来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是主要抗原， 常用生长抑制试验常用生长抑制试验(GIT)与代谢抑制试验与代谢抑制试验 (MIT)鉴定。

鉴定GIT是将吸有型特异性抗血清是将吸有型特异性抗血清 的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上，的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上， 经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现 象MIT是将支原体接种在含有抗血清培养是将支原体接种在含有抗血清培养 基中，若抗体与支原体型一致，则抑制该支基中，若抗体与支原体型一致，则抑制该支 原体不能分解葡萄糖产酸此两种方法可将原体不能分解葡萄糖产酸此两种方法可将 支原体分成若干血清型支原体分成若干血清型3 3．培养特性．培养特性 以二分裂繁殖，繁殖较慢；生以二分裂繁殖，繁殖较慢；生 长需要胆固醇；反复传代后呈长需要胆固醇；反复传代后呈“荷包蛋荷包蛋” 状菌落，可迅速溶解哺乳动物红细胞状菌落，可迅速溶解哺乳动物红细胞4 4．生化反应．生化反应 肺炎支原体可根据是否能利用肺炎支原体可根据是否能利用 葡萄糖、水解精氨酸和尿素来与其他支原葡萄糖、水解精氨酸和尿素来与其他支原 体进行鉴别体进行鉴别 5.5.抵抗力抵抗力1.1.对热的抵抗力一般与细菌相似。

耐冷，对热的抵抗力一般与细菌相似耐冷， -70℃ -70℃或液氮可长期冻存或液氮可长期冻存, 4℃, 4℃放置也不放置也不 要超过要超过3 3天2.2.支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分离出支原体没有细胞壁青霉素不敏感离出支原体没有细胞壁青霉素不敏感 检验程序检验程序1 .标本采集标本采集 肺炎支原体有粘附细胞作用，以肺炎支原体有粘附细胞作用，以 咽拭子标本为好，取材后宜立即接种咽拭子标本为好，取材后宜立即接种2. PCR法快速、敏感和特异，目前某些临床实法快速、敏感和特异，目前某些临床实 验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中 检测肺炎支原体检测肺炎支原体DNA 3. 电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别 4.分离培养分离培养n以牛心消化液为基础以牛心消化液为基础, ,加加2020％小牛血清及新％小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基加入鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基加入青霉素青霉素, ,可防止杂菌生长初次分离生长缓可防止杂菌生长。

初次分离生长缓慢，在含慢，在含5 5％％C02C02下培养，下培养，1010天长出油煎蛋状天长出油煎蛋状菌落能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸菌落能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸与尿素，可还原美蓝分离培养阳性率不高，与尿素，可还原美蓝分离培养阳性率不高，对临床诊断意义不大对临床诊断意义不大, , 但对流行病学调查有但对流行病学调查有重要意义重要意义 5．抗体检测抗体检测(1)ELISA：：此此法法敏敏感感，，特特异异性性高高，，快快速速、、经经济济，，并并可可检检测测IgM和和IgG抗抗体体，，为为目目前前诊诊断断的的可可靠靠方方法法检检测测分分子子量量190kDa的的P1蛋蛋白白，，3h可可完完成成试试验验，，特特异异性性高高，，敏敏感性为感性为10 4CFU／／μl标本(2)(2)补体结合补体结合( (CF)CF)试验试验n试验所用的抗原为氯仿试验所用的抗原为氯仿··甲醇提取的糖甲醇提取的糖脂类抗原脂类抗原n双份血清试验，效价呈双份血清试验，效价呈4 4倍增长者，或单倍增长者，或单份血清效价份血清效价≥≥l l：：128128者，者，8080％的病例表％的病例表明近期有肺炎支原体感染。

明近期有肺炎支原体感染(3)(3)间接血凝试验间接血凝试验n操操作作简简便便，，敏敏感感度度略略高高于于补补体体结结合合试试验验，，感感染染发发病病后后7 7天天出出阳阳性性，，10-3010-30天天达达高高峰峰，，12-2612-26周逐渐降低周逐渐降低n本试验与补体结合试验类似，主要测本试验与补体结合试验类似，主要测lgMlgM 抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反 应(4)(4)冷凝集试验冷凝集试验 是一种非特异性试验其方法是将患者血是一种非特异性试验其方法是将患者血清与清与O型型Rh阴性红细胞在阴性红细胞在4 ℃下作凝集试下作凝集试验有33％％—76％肺炎支原体感染者为阳％肺炎支原体感染者为阳性性 (效价效价≥1：：64)效价越高或双份血清呈效价越高或双份血清呈4倍以上升高，肺炎支原体近期感染的可能倍以上升高，肺炎支原体近期感染的可能性越大 二、解脲脲原体二、解脲脲原体n也也称称溶溶脲脲脲脲原原体体，，是是1954年年Shepard首首先先从从非非淋淋菌菌性性尿尿道道炎炎(NGU)患患者者的的尿尿道道分分泌泌物物中中分分离离获获得得，，因因其其分分解解尿尿素素的的特特性性命命名名为为解解脲脲脲脲原原体体。

在在分分类类学学上上属属人人支支原原体体科科脲脲原原体体属属是是人人类类泌泌尿尿生生殖殖道道最最常常见见的的寄寄生生菌菌之之一一，，近近年年来来研研究究发发现现，，它它与与多多种种疾疾病病有有关关，，故故引引起起国国内内外外有有关关学学者的广泛重视者的广泛重视1.寄寄居居泌泌尿尿生生殖殖道道，，传传播播途途径径为为性性接接触触和和母母婴婴传传播播致致病病机机制制与与侵侵袭袭性性酶酶有有关关吸吸附附后后产产生生磷磷脂脂酶酶分分解解胞胞膜膜中中的的磷磷脂脂，，脲脲酶酶分分解解尿尿素素产产氨氨，，影影响响宿宿主主细细胞胞生生物物合合成成产产生生IgA蛋蛋白白酶酶，，破破坏坏IgA的的局局部部抗抗感感染染作作用用，，有利于粘附和致病有利于粘附和致病2.引引起起非非淋淋菌菌性性尿尿道道炎炎(NGU) ，，上上行行感感染染，，可可引引起起前前列列腺腺炎炎或或附附睾睾炎炎；；阴阴道道炎炎和和宫宫颈颈炎炎，，并并可可导导致致流流产产因因为为与与人人精精子子膜膜有有共共同同抗抗原，对精子可造成免疫损伤而致不育原，对精子可造成免疫损伤而致不育微生物特性微生物特性1．．形形态态结结构构 在在液液体体培培养养基基中中以以球球形形为为主主，，直直径径约约50-300nm，，单单个个或或呈呈双双排排列列，，能能通通过过微微孔孔滤滤膜膜；；G-但但不不易易着着色色，，姬姬姆姆萨萨染染色色呈呈紫紫蓝蓝色色。

无无细细胞胞壁壁，，细细胞胞膜膜由由三三层层膜膜构构成成内内、、外外两两层层由由蛋蛋白白质质组组成成，，中中层层为为类类脂脂质质，，胞胞内内含含核核糖糖体体和和双双股股DNADNA中中Ｇ十Ｇ十C含量为含量为26．．9～～29．．8mol％ 2 2．培养特性．培养特性n营营养养要要求求较较高高，，需需要要供供给给胆胆固固醇醇和和酵酵母母，，常常用用的的基基础础培培养养基基为为牛牛心心消消化化液液37℃生生长长良良好好，，22℃生生长长差差，，42℃不不生生长长，，最最适适pH为为5．．5-6．．5在在含含95％％N2和和5％％C02气气体体环环境境下下培培养养2天天形形成成很很小小菌菌落落，，呈呈“荷荷包包蛋蛋”样样，，放放大大200倍倍才才能能观观察察到到，，故故称称T株株生生长长除除胆胆固固醇醇外外，，尚尚需需尿尿素素，，有有脲脲酶酶能能水水解解尿尿素素产产氨氨，，不分解葡萄糖和精氨酸不分解葡萄糖和精氨酸3.3.抗原构造抗原构造n有脂多糖、脲酶和蛋白质抗原，有有脂多糖、脲酶和蛋白质抗原，有16个血清个血清型划分为型划分为A、、B两大群，其中以两大群，其中以4型引起疾病型引起疾病频率高。

频率高A群各型均含有群各型均含有16kD和和17kD多肽；多肽；B群各型仅含群各型仅含17kD多肽；而多肽；而13血清型只含有血清型只含有16kD多肽，以能识别多肽，以能识别16kD和和17kD多肽的单多肽的单抗，为区别血清群特异性标志抗，为区别血清群特异性标志 4 4．抵抗力．抵抗力n由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易被脂类溶媒、清洁剂、酒精、特异性抗体被脂类溶媒、清洁剂、酒精、特异性抗体和补体溶解对热抵抗力差在和补体溶解对热抵抗力差在4℃存活约存活约2周左右，周左右，—70℃中可存活中可存活 2-3年n对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感：对强对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感：对强力霉素、红霉素、交沙霉素、白霉素、螺力霉素、红霉素、交沙霉素、白霉素、螺旋霉素、氯霉素、麦迪霉素、链霉素、丁旋霉素、氯霉素、麦迪霉素、链霉素、丁胺卡那霉素等敏感胺卡那霉素等敏感 微生物检验微生物检验 1．标本采集．标本采集 用用无无菌菌瓶瓶收收集集诊诊断断为为非非淋淋菌菌性性尿尿道道炎炎患患者者中中段段尿尿，，慢慢性性前前列列腺腺炎炎按按摩摩后后的的前前列列腺腺液液，，原原因因不不明明的的不不育育症症患患者者的的精精液液，，阴阴道道炎炎与与宫宫颈颈炎炎患患者者的的炎炎性性分分泌泌物物，，羊羊水水和和血血液液等等。

尿尿标标本以无菌方法取本以无菌方法取10ml，，离心沉渣作接种物离心沉渣作接种物  2 2．标本直接检查．标本直接检查 (1)核酸检测核酸检测n16个个血血清清型型均均有有460bp的的DNA片片段段通通过过对对PCR产产物物的的核核酸酸杂杂交交和和序序列列分分析析，，可可将将各各种种支支原原体体鉴鉴别别分分类类鉴鉴于于本本法法敏敏感感性性高高、、稳稳定定可可靠靠、、快快速速简简便便，，将将成成为为临临床床快快速速诊诊断的重要实验手段断的重要实验手段 nDNA探探针针技技术术法法敏敏感感，，可可测测出出50～～100pg的的DNA(2)ELISA 可可测测定定血血清清型型别别，，还还可可测测出出Ig的的类类型型(IgM、、IgG)，，较较敏敏感感、、特特异异性性强强，，有有诊诊断意义3)免疫斑点试验免疫斑点试验(IDT) 检检测测抗抗原原提提取取物物和和培培养养物物此此法法敏敏感感，，特特异异性性，，不不需需特特殊殊仪仪器器，，易易于于推推广广，，可可作作为为临临床床感感染染者者病病原原检检查查的的特特异异诊诊断断方方法3 3．分离与鉴定．分离与鉴定n取标本取标本O．．1～～0．．2ml接种于接种于pH6．．0含有酚红含有酚红和尿素的液体培养和尿素的液体培养37℃孵育，颜色由黄变红孵育，颜色由黄变红者为阳性。

阳性者转种于固体培养基上，琼者为阳性阳性者转种于固体培养基上，琼脂培养基中有尿素、脂培养基中有尿素、0．．05molHEPES缓冲液缓冲液和和MgS04，，菌落呈黑褐色易辨认菌落呈黑褐色易辨认 ，，95％％N2～～5％％C02或微厌氧环境中作次代培养，以低倍或微厌氧环境中作次代培养，以低倍镜观察菌落形态镜观察菌落形态n经形态和生化反应等检测可作出初步鉴定经形态和生化反应等检测可作出初步鉴定只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸用只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸用特异抗血清作特异抗血清作MIT和和GIT作进一步鉴定作进一步鉴定 三、穿通支原体三、穿通支原体 n能能粘粘附附、、穿穿入入淋淋巴巴细细胞胞和和单单核核吞吞噬噬细细胞胞中中大大量量复复制制，，导导致致宿宿主主细细胞胞受受损损和和死死亡亡能能促促进进HIVHIV的的复复制制和和病病程程的的发发展展，，是是艾艾滋滋病病的辅助致病因素的辅助致病因素n为为杆杆状状，，一一端端为为尖尖形形结结构构营营养养要要求求高高，，菌菌落落呈呈荷荷包包蛋蛋样样，，生生长长较较慢慢，，初初代代多多在在1010天天以以上上，，发发酵酵葡葡萄萄糖糖，，水水解解精精氨氨酸酸，，但但不不分分解解尿尿素素，，液液体体培培养养基基生生长长时时无无明明显显混混浊浊或沉淀。

或沉淀n对对红红霉霉素素、、四四环环素素、、林林可可霉霉素素敏敏感感，，但但对对青霉素不敏感青霉素不敏感 微生物检验微生物检验1．标本采集．标本采集 取材对象是取材对象是AIDS患者或患者或HIV 感染者用咽拭子用咽拭子2．选．选SP-4培养基分离培养，培养基分离培养，37℃温箱培养，温箱培养， 每天观察颜色有无变化，若由红变黄透明每天观察颜色有无变化，若由红变黄透明 无沉淀，视无沉淀，视“培养可疑阳性培养可疑阳性”，再用滤膜，再用滤膜过过 滤滤液转种传代，当培养基颜色再度由滤滤液转种传代，当培养基颜色再度由 红变黄，则认为红变黄，则认为“初代培养阳性初代培养阳性” 3.3.鉴定鉴定 生化反应生化反应 (1)培养物接种于含培养物接种于含1％葡萄糖的％葡萄糖的SP-4培养基培养基 (发酵葡萄糖试验发酵葡萄糖试验)，若能分解它，培养基，若能分解它，培养基 颜色由红变黄颜色由红变黄 (2)培养物接种于含有精氨殿培养物接种于含有精氨殿(不含葡萄糖不含葡萄糖) 的的SP-4培养基培养基(水解精氨酸试验水解精氨酸试验)中，若中，若 能水解它，能水解它，pH上升。

上升 (3)培养物接种于仅含尿素的培养物接种于仅含尿素的SP-4培养基培养基(分分 解尿素试验解尿素试验)中，观察中，观察 pH变化代谢抑制试验代谢抑制试验(MIT)n取取104CFU／／ml阳性培养物分别加入阳性培养物分别加入2支含支含3ml改良的改良的SP-4培养基中，其中培养基中，其中1支加入适支加入适量抗量抗Mpe标准血清作为试验管，另标准血清作为试验管，另1支不加支不加抗血清作为对照管，抗血清作为对照管，37℃培养n试验管颜色不变试验管颜色不变(生长被抑制生长被抑制)，对照管颜，对照管颜色由红变黄色由红变黄(支原体生长支原体生长)生长被杭血清生长被杭血清抑制的管为抑制的管为MIT阳性，该培养物则为阳性，该培养物则为Mpe，，根据抗血清的型别进行根据抗血清的型别进行Mpe分型分型PCR 用用Mpe套套式式PCR(nPCR)，，靶靶基基因因为为Mpe的的16SrRNA基基因因特特异异性性片片段段Mpe-nPCR最最终终扩扩增增长长度度为为410bp，，按按试试剂剂盒盒说说明明书书操操作作，，能能扩扩增增出出特特异异性性MpeDNA，，认认为为此此法法更灵敏、特异、快速的更灵敏、特异、快速的Mpe检测方法。

检测方法抗体检测抗体检测n国国外外学学者者在在HIV感感染染者者中中用用ELISA法法检检测测出出大大量量Mpe抗抗体体，，其其中中无无症症状状者者的的阳阳性性率率为为20％％，，有有艾艾滋滋病病者者为为40％％，，阴阴性性对对照照0.3％第二节 衣 原 体 n是一类专性细胞内寄生、有独特发育周是一类专性细胞内寄生、有独特发育周期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生物归属于广义的细菌范畴归属于广义的细菌范畴n衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种一、沙眼衣原体一、沙眼衣原体n不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病n近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医学界的重视学界的重视n沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽肿生物变种（肿生物变种（LGV））和鼠生物变种等和鼠生物变种等3个生个生物变种。

物变种1．沙眼亚种．沙眼亚种(1)沙眼：沙眼： 通过眼通过眼-手手-眼途径直接或间接密切接触传眼途径直接或间接密切接触传 播由A、、B、、Ba和和C血清型引起结膜引血清型引起结膜引 起局部炎症有滤泡增生后期出现瘢痕起局部炎症有滤泡增生后期出现瘢痕 及角膜血管翳，影响视力及角膜血管翳，影响视力(2)(2)包涵体结膜炎：包涵体结膜炎： 由由B B、、BaBa、、D D、、DaDa等血清型引起婴儿通过等血清型引起婴儿通过 产道感染，引起滤泡性结膜炎，不出现角产道感染，引起滤泡性结膜炎，不出现角 膜血管翳膜血管翳3)(3)泌尿生殖道感染：泌尿生殖道感染： 由由D-KD-K血清型引起在性接触传播引起的血清型引起在性接触传播引起的 非淋菌性泌尿生殖道感染（非淋菌性泌尿生殖道感染（5050％％—60—60％） 易发展为持续感染或无症状携带者易发展为持续感染或无症状携带者 2.2.性病淋巴肉芽肿亚种，由性病淋巴肉芽肿亚种，由L L血清型引起血清型引起性病淋巴肉芽肿侵犯腹股沟淋巴结，性病淋巴肉芽肿侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。

引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿3.3.鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠肺炎有关鼠肺炎有关 微生物特性微生物特性1．．发育周期与形态染色发育周期与形态染色 衣原体具有特殊的发衣原体具有特殊的发育周期①①原体是细胞外存在形式，卵圆形，原体是细胞外存在形式，卵圆形，有胞壁和拟核有胞壁和拟核, 是发育成熟的衣原体，具有高是发育成熟的衣原体，具有高度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增大形成网状体；大形成网状体；②②网状体或称始体，圆形，网状体或称始体，圆形，二分裂增殖为繁殖型，无感染性于感染二分裂增殖为繁殖型，无感染性于感染24h后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，再感染其他细胞，每个发育周期约需再感染其他细胞，每个发育周期约需48—72h 抗原结构抗原结构复杂，有属、种、型等特异性抗原复杂，有属、种、型等特异性抗原 (1)属特异性抗原：为胞壁属特异性抗原：为胞壁LPS，，属特异性补属特异性补 体结合抗原，应用于血清学诊断体结合抗原，应用于血清学诊断 (2)种特异性抗原：位于主要外膜蛋白种特异性抗原：位于主要外膜蛋白 （（MOMP））上，可用补体结合试验和中和上，可用补体结合试验和中和 试验检测。

试验检测 (3)型特异性抗原：也位于型特异性抗原：也位于MOMP上，用单上，用单 克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼 体的体的18个型别 培养特性培养特性n沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用6—8d龄龄鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养一般培鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养一般培养养48—72h后可在细胞内查到包涵体及原体后可在细胞内查到包涵体及原体和始体颗粒和始体颗粒n近近年年多多采采用用细细胞胞培培养养衣衣原原体体，，常常用用的的细细胞胞株为株为Hela-299和和McCoy抵抗力抵抗力n沙眼衣原体感染材料在沙眼衣原体感染材料在37℃条件下，经条件下，经48h左右即失去活力，左右即失去活力，56℃6 min灭活70℃可保存数年，冷冻干燥可保存可保存数年，冷冻干燥可保存30年以上仍年以上仍有活性O.1％％甲醛或甲醛或O.5％％石炭酸溶液石炭酸溶液24h杀死沙眼衣原体，杀死沙眼衣原体，2％来苏仅需％来苏仅需5minn红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣原体有抑制作用原体有抑制作用。

 沙沙眼眼和和包包涵涵体体结结膜膜炎炎病病人人，，用用拭拭子子在在结结膜膜上上穹穹窿窿涂涂擦擦或或取取结结膜膜刮刮片片性性病病淋淋巴巴肉肉芽芽肿肿：：采采淋淋巴巴结结脓脓汁汁，，也也可可取取直直肠肠拭拭子子或或活活检检材材料料送检 用用光光学学显显微微镜镜观观察察包包涵涵体体有有诊诊断断意意义义，，特特别别在在眼眼结结膜膜、、尿尿道道及及子子宫宫颈颈上上皮皮细细胞胞内内发发现现典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考免疫学方法免疫学方法1)免免疫疫荧荧光光检检查查：：用用荧荧光光抗抗体体检检测测上上皮皮细细胞胞内内衣衣原原体体抗抗原原标标记记抗抗衣衣原原体体LPS抗抗体体，，可可与与所所有有衣衣原原体体反反应应；；而而抗抗MOMP抗抗体体有有种种、、型型特特异异性性可可在在1h内内即即作作出出诊诊断断并并可可分型2)酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本 核酸检测核酸检测1)核核酸酸杂杂交交：：用用125I标标记记的的衣衣原原体体rDNA探探针针检检测测宫宫颈颈标标本本的的敏敏感感性性和和特特异异性性，，与与培培养养相相比比分别为分别为82.8％和％和99.4％。

％2)PCR：：具有高度敏感性和特异性一般按沙具有高度敏感性和特异性一般按沙眼衣原体眼衣原体7．．5kb质粒、质粒、MOMP序列及序列及16SrRNA基因序列设计引物基因序列设计引物 分离培养分离培养n将将标标本本拭拭子子，，用用含含抗抗生生素素的的稀稀释释液液制制成成10％％-20％％悬悬液液分分离离的的细细胞胞有有McCoy、、HeLa-229细胞等置细胞等置5％％CO2下培养n初初代代分分离离培培养养72-96h后后传传代代或或盲盲传传有有症症状状病病人人90％％标标本本第第1代代即即可可见见包包涵涵体体，，而而无无症症状病人需传代后才得到阳性状病人需传代后才得到阳性n敏敏感感性性为为80％％-90％％，，特特异异性性100％％，，是是目目前前确确诊诊最最可可靠靠的的方方法法，，而而且且是是评评价价实实验验室室诊诊断断法的标准法的标准鸡胚培养鸡胚培养n有细菌污染的临床标本加适当的抗生素有细菌污染的临床标本加适当的抗生素(如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等)肉肉汤，在室温中作用汤，在室温中作用lh后，接种后，接种3-4只孵育只孵育7天的鸡胚卵黄囊，天的鸡胚卵黄囊，35℃孵育，观察至孵育，观察至13天，收获卵黄囊涂片，作天，收获卵黄囊涂片，作Gimenez染染色，镜检原体。

色，镜检原体 鉴定鉴定1.将细胞培养盖片用将细胞培养盖片用Giemsa或碘染色镜检或碘染色镜检胞质内包涵体胞质内包涵体Giemsa染色比碘染色敏染色比碘染色敏感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考2.可用型特异性荧光血清鉴定其型别对可用型特异性荧光血清鉴定其型别对于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原光法鉴定原体或补体结合抗原 抗体检测抗体检测n目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价值很小n原因是不易获得双份血清，而且性传播疾病的高原因是不易获得双份血清，而且性传播疾病的高危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，因而限制了血清学方法的诊断价值因而限制了血清学方法的诊断价值n方法有补体结合试验方法有补体结合试验(CF)、、微量免疫荧光试验微量免疫荧光试验(MIF)、、酶免疫法等其中酶免疫法等其中CF敏感性和特异性较敏感性和特异性较差，而差，而MIF敏感性和特异性较高敏感性和特异性较高 三、鹦鹉热衣原体三、鹦鹉热衣原体n鹦鹦鹉鹉热热衣衣原原体体是是鹦鹦鹉鹉热热的的病病原原体体，，主主要要引引起起禽禽畜畜感感染染，，也也可可由由动动物物传传染染到到人人，，引引起起肺炎和毒血症，亦有引起心内膜炎的报道。

肺炎和毒血症，亦有引起心内膜炎的报道n也也有有衣衣原原体体独独特特的的生生活活周周期期，，包包涵涵体体较较致致密密，，形形态态不不一一，，碘碘染染色色阴阴性性，，是是与与沙沙眼眼衣衣原原体体鉴鉴别别要要点点 (沙沙眼眼衣衣原原体体含含糖糖原原，，碘碘染染色阳性色阳性)抗原检测抗原检测1)免免疫疫荧荧光光检检查查：：以以衣衣原原体体属属、、种种或或型型的的单单克克隆隆抗抗体体与与荧荧光光素素结结合合后后中中衣衣原原体体抗抗原原的的存存在在，，用用微微量量免免疫疫荧荧光光法法还还可可用用于于衣衣原原体体的分型2)酶酶免免疫疫法法(EIA)检检测测：：将将衣衣原原体体单单克克隆隆抗抗体体与与酶酶结结合合，，用用于于组组织织或或细细胞胞的的染染色色，，枪枪测测衣衣原原体体抗抗原原E1A法法比比免免疫疫荧荧光光法法准准确确性略高，且可避免主观因素的影响性略高，且可避免主观因素的影响核酸检测核酸检测1)核核酸酸探探针针检检测测法法：：将将衣衣原原体体MOMP基基因因、、特特异异LPS表表位位基基因因，，及及其其他他决决定定鹦鹦鹉鹉热热衣衣原原体体抗抗原原的的基基因因片片段段做做成成探探针针，，对对衣衣原原体体DNA进进行行斑斑点点杂杂交交或或Southern印印迹迹杂杂交交试试验验，，可可准准确确灵灵敏敏测测出出鹦鹦鹉鹉热热衣衣原原体体，，也也可可用用于于种种内株系的鉴别。

内株系的鉴别2)PCR：： 检测检测3种衣原体的种衣原体的MOMP基因序列是基因序列是简便、微量、快速、敏感的检测力法简便、微量、快速、敏感的检测力法 分离培养分离培养(1)鸡鸡胚胚培培养养：：鹦鹦鹉鹉热热衣衣原原体体的的分分离离常常用用鸡鸡胚胚卵卵 黄囊接种与传代，可取得满意效果黄囊接种与传代，可取得满意效果2)小小鼠鼠分分离离：：选选择择腹腹腔腔接接种种、、颅颅内内接接种种和和滴滴鼻鼻 接种进行试验最具特征性的发现小鼠嗜眠接种进行试验最具特征性的发现小鼠嗜眠 和麻痹，胀气的十二指肠上覆盖一层薄的粘和麻痹，胀气的十二指肠上覆盖一层薄的粘 性渗出物，全肺叶有实变性渗出物，全肺叶有实变(3)细胞培养：细胞培养常用细胞培养：细胞培养常用PL细胞、细胞、BHK细细 胞、胞、Vero细胞等，鹦鹉热衣原体均能生长细胞等，鹦鹉热衣原体均能生长 但直接用于临床标本的分离培养效果不好，但直接用于临床标本的分离培养效果不好， 最好先接种鸡胚卵黄囊，经繁殖后再细胞培最好先接种鸡胚卵黄囊，经繁殖后再细胞培 养容易成功养容易成功 抗体检测抗体检测方法有补体结合试验方法有补体结合试验(CF)、、间接血凝试验间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试和酶联免疫吸附试 (ELISA)等。

等补体结合试验：主要用于鹦鹉热和性病淋巴肉补体结合试验：主要用于鹦鹉热和性病淋巴肉芽肿以及肺炎的试验芽肿以及肺炎的试验CF抗体效价呈抗体效价呈4倍增长倍增长者可作诊断一次者可作诊断一次CF抗体结果，需效价高于抗体结果，需效价高于1：：64才可能作临床诊断才可能作临床诊断 四、肺炎衣原体四、肺炎衣原体 n肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种，只肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种，只有一个血清型，是一种重要的呼吸道病原有一个血清型，是一种重要的呼吸道病原体主要引起青少年急性呼吸道感染，可体主要引起青少年急性呼吸道感染，可引起肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎等引起肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎等n还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎肺还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎肺炎衣原体性感染与急性心肌梗死和慢性冠炎衣原体性感染与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系，越来越引起人们的注意心病的关系，越来越引起人们的注意 微生物特性微生物特性1．有衣原体独特的生活周期，原体在电镜下呈．有衣原体独特的生活周期，原体在电镜下呈 型的梨形，并有清晰的周浆间隙型的梨形，并有清晰的周浆间隙2．全基因组测序已完成，与鹦鹉热衣原体、沙．全基因组测序已完成，与鹦鹉热衣原体、沙 眼衣原体的眼衣原体的DNA同源性同源性≤10％，而不同来％，而不同来 擗擗TWAR株都具有株都具有94％以上的％以上的DNA同源性，同源性， 其限制性内切酶的图谱相同。

其单克隆抗体其限制性内切酶的图谱相同其单克隆抗体 与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应3．用．用HEp-2和和HL细胞系较易分离和传代细胞系较易分离和传代 抗体检测抗体检测以微量免疫荧光试验以微量免疫荧光试验(MIF)最为敏感，该试验最为敏感，该试验阳性者阳性者50％～％～70％可分离出％可分离出 TWAR，，用此法用此法检测特异性的检测特异性的IgM和和IgG抗体，有利于区别近抗体，有利于区别近期感染和既往感染，也有利于区别原发感染期感染和既往感染，也有利于区别原发感染和再感染，和再感染，TWAR的再感染相当常见，特别的再感染相当常见，特别是老年人，再感染时一般不出现是老年人，再感染时一般不出现lgM和补体结和补体结合抗体第三节第三节 立克次体立克次体 对人致病的立克次体有五个属立克次体属、对人致病的立克次体有五个属立克次体属、柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴通体属 共同特点共同特点①①大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病；疹性疾病；②②以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；③③大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性；性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性；④④除了少数外全是专性活细胞内寄生；除了少数外全是专性活细胞内寄生；⑤⑤菌体内同时含有菌体内同时含有DNADNA和和 RNARNA两类核酸；两类核酸；⑥⑥以二分裂方式进行繁殖；以二分裂方式进行繁殖；⑦⑦对抗生素敏感。

对抗生素敏感 一、斑疹伤寒立克次体 (一一)临床意义临床意义 1．普氏立克次体是流行性斑疹伤寒．普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传又称虱传 斑疹伤寒斑疹伤寒)的病原体的病原体 病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介，病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介， 而非储存宿主而非储存宿主 传播方式为虱传播方式为虱-人人-虱，体虱仅是传染媒介虱，体虱仅是传染媒介莫氏立克次体莫氏立克次体n地方性斑疹伤寒地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒又称鼠型斑疹伤寒)的病原的病原体啮齿类动物是主体啮齿类动物是主§宿主，传播媒介是鼠宿主，传播媒介是鼠蚤或鼠虱蚤或鼠虱n鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤寒立克次体从抓破的伤口进入人体若有人寒立克次体从抓破的伤口进入人体若有人虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地在人群中传播在人群中传播 致病物质致病物质n有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖(LPS)；；其二为磷脂酶其二为磷脂酶A,能损伤宿主细胞膜能损伤宿主细胞膜及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿主细胞并在其中生长。

主细胞并在其中生长n普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性器官损伤器官损伤 (二二)微生物特性微生物特性1. 比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚 集成团集成团,分布在胞质内分布在胞质内, Gimenez法染色后法染色后 呈红色，外表含有微荚膜结构呈红色，外表含有微荚膜结构2. 必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时 需需要要C02通通常常采采用用5-9日日龄龄鸡鸡胚胚作作卵卵黄黄囊囊接接种种，，于于32℃-35℃孵孵育育4～～13d内内死死亡亡，，鸡鸡胚胚死死亡亡时时间间与与接接种种剂剂量量大大小小呈呈直直接接相相关关普普氏氏和和莫莫氏氏立立克克次次体体能能在在多多种种单单层层细细胞胞上上生生长长繁殖豚鼠可作立克次体的初代分离豚鼠可作立克次体的初代分离3.有有群群特特异异性性和和种种特特异异性性两两种种抗抗原原。

大大部部分分立立克克次次体体与与普普通通变变形形杆杆菌菌X菌菌株株的的菌菌体体耐耐热热多多糖糖抗抗原原有有共共同同的的抗抗原原性性，，故故可可用用这这些些菌菌株株代代替替立立克克次次体体抗抗原原进进行行凝凝集集反反应应去去检检测测抗抗体体，，这这种种交交叉叉凝凝集集试试验验被被称称为为外外斐斐反反应，可供辅助诊断应，可供辅助诊断 外斐反应外斐反应 立克次体病立克次体病 变形杆菌变形杆菌 　　OX19OX19变形杆菌变形杆菌 　　OX2OX2变形杆菌变形杆菌 　　OXkOXk流行性斑疹伤寒流行性斑疹伤寒 +++++++++ +- -地方性斑疹伤寒地方性斑疹伤寒 +++++++++ +- -斑点热斑点热++++/+++++/++/+ ++++/+ +++- -恙虫病恙虫病- -- -++++++++腺热腺热- -- -++++( (三三) )微生物检验微生物检验1.1.标本采集标本采集(1)(1)病人血液标本：发热期均有立克次体血症，病人血液标本：发热期均有立克次体血症， 在急性期较易检出立克次体争取在用在急性期较易检出立克次体争取在用抗抗生生 素前采血，立即床侧接种。

素前采血，立即床侧接种2)(2)活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心 瓣膜等标本瓣膜等标本 2.2.标本直接检查标本直接检查(1)免免疫疫荧荧光光检检测测 用用于于脏脏器器检检查查制制备备标标本本片片薄薄而而均均匀匀，，组组织织结结构构清清晰晰，，固固定定后后用用荧荧光光抗抗体体染染色色, 常常见见脾脾、、肺肺及及心心瓣瓣膜膜中中有有立立克克次次体体，，也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出2)核核酸酸检检测测 PCR敏敏感感性性高高，，所所需需样样品品量量只只需需ELISA实实验验的的1／／5以以编编码码17kD蛋蛋白白的的基基因因和和编编码码普普氏氏和和莫莫氏氏立立克克次次体体169kD蛋蛋白白的的基基因因作为扩增靶区作为扩增靶区n引引物物R17-1、、-2在在65℃条条件件下下能能扩扩增增普普氏氏和和莫莫氏氏立立克克次次体体DNA在在琼琼脂脂凝凝胶胶上上产产生生一一条条340bp的核酸带；的核酸带；n引引物物R169-1、、-2仅仅能能扩扩增增普普氏氏立立克克次次体体DNA，，产产生生一一条条432bp的的核核酸酸带带。

两两种种引引物物同同时时使使用用，，扩扩增增后后普普氏氏可可产产生生340bp和和432bp两两条条带带，，而莫氏只产生而莫氏只产生340bp一条带n该该法法敏敏感感性性可可达达0．．05ngDNA水水平平，，重重复复性性好好，，操操作作方方便便，，对对两两型型立立克克次次体体早早期期、、鉴鉴别别诊诊断断以以及及自自然然生生态态宿宿主主调调查查研研究究具具有有较较大大价价值3 3．分离培养．分离培养(1)动物接种动物接种 选选用用健健康康雄雄性性豚豚鼠鼠接接种种以以便便观观察察阴阴囊囊肿肿胀胀现现象象每每日日测测体体温温，，至至40℃发发热热时时采采血血或或脏脏器器悬悬液液、、接接种种鸡鸡胚胚卵卵黄黄囊囊或或细细胞胞培培养养以以分分离离立立克次体；克次体； 感感染染莫莫氏氏立立克克次次体体豚豚鼠鼠在在发发热热1—2日日内内出出现现阴阴囊囊红红肿肿，，解解剖剖可可见见腹腹股股沟沟淋淋巴巴结结肿肿大大、、充充血血、、脾脾大大2-3倍倍，，有有腹腹水水；；有有阴阴囊囊反反应应者者，，睾睾丸丸有有小小出出血血点点，，鞘鞘膜膜充充血血并并有有浆浆液液性性渗渗出出物物等鞘膜涂片可查到立克次体。

等鞘膜涂片可查到立克次体(2)(2)鉴定鉴定n用用免免疫疫荧荧光光法法鉴鉴定定感感染染动动物物脏脏器器、、鸡鸡胚胚卵卵黄黄囊囊、、细细胞胞培培养养物物中中的的特特异异性性抗抗原原以以已已知知抗抗原原测测定定动动物物恢恢复复期期血血清清中中的的相相应应抗抗体体必必要要时时用用补补体体结结合合试试验验、、微微量量凝凝集集试试验验等等，，作群和种的鉴定作群和种的鉴定(3)(3)分离株繁殖及保存分离株繁殖及保存①①鸡胚卵黄囊培养鸡胚卵黄囊培养 收获卵黄囊，经涂片染收获卵黄囊，经涂片染色镜检色镜检, 含立克次体较多而又未发现细菌含立克次体较多而又未发现细菌的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬液置液置-70℃冰箱保存，或冰冻干燥保藏；冰箱保存，或冰冻干燥保藏；②②细胞培养：选鸡胚、成纤维、人羊膜、细胞培养：选鸡胚、成纤维、人羊膜、HeLa等细胞，接种培养、鉴定后将立克等细胞，接种培养、鉴定后将立克次体大量繁殖的感染细胞置次体大量繁殖的感染细胞置-70℃储存 4 4．抗体检测．抗体检测立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐反应、间接免疫荧光反应、间接免疫荧光(IFA )试验、酶联免试验、酶联免疫吸附试验疫吸附试验(ELISA)外，还有补体结合外，还有补体结合(CF)试验、微量凝集试验、微量凝集(MA)试验、间接血凝试验、间接血凝(IHA)试验、胶乳凝集试验、胶乳凝集(LA)试验等试验等 。

(1)(1)外斐反应外斐反应除除Q热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性外，其他为阳性外，其他为阳性患者患者OX凝集素上升较晚，在病程凝集素上升较晚，在病程2周左右方出周左右方出现阳性，病程中双份血清试验，若效价有现阳性，病程中双份血清试验，若效价有4倍倍增长，方有诊断意义增长，方有诊断意义有些病例在病程中效价不见上升，约有些病例在病程中效价不见上升，约15％的％的经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例有些经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血清学试验阳性，但外斐反应可为阴性清学试验阳性，但外斐反应可为阴性斑点热病人外斐反应效价通常为斑点热病人外斐反应效价通常为OX19高于高于OX2，，但也有但也有OX2较高者若仅出现较高者若仅出现OX2阳性，则对诊断斑点热有特殊意义阳性，则对诊断斑点热有特殊意义 (2)IFA试验试验为为现现在在诊诊断断立立克克次次体体病病常常用用的的方方法法用用已已知知立立克克次次体体抗抗原原( (感感染染鸡鸡胚胚卵卵黄黄囊囊或或细细胞胞培培养养悬悬液液) )制制片片，，以以低低稀稀释释度度的的病病人人血血清清初初筛筛，，有有呈呈典典型型立立克克次次体体形形态态的的明明亮亮荧荧光光颗颗粒粒者者，，判判为为阳阳性性。

再再将将病病程程早早期期及及晚晚期期血血清清分分别别作作双双倍倍或或4 4倍倍稀稀释释以以测测效效价价，，如如呈呈4 4——8 8倍倍增增长长者可明确诊断者可明确诊断(3)ELISAn检测检测IgMIgM抗体对早期诊断有价值抗体对早期诊断有价值n立立克克次次体体抗抗原原吸吸附附于于载载体体泛泛影影葡葡胺胺梯梯度度离离心心纯纯化化抗抗原原为为优优，，检检出出血血清清的的抗抗体体效效价价高高，，纸纸上上ELISAELISA测测定定抗抗体体，，方方法法简简便便将将感感染染卵卵黄黄囊囊悬悬液液加加于于玻玻片片( (经经氯氯仿仿·甲甲醇醇洗洗净净) )上上，，凉凉干干、、固固定定，，加加稀稀释释血血清清于于抗抗原原点点上上，，每每张张玻玻片片上上包包括括阳阳性性和和阴阴性性对对照照，，加加酶酶标标兔兔抗抗人人IgMIgM/G/G于于抗抗原原·血血清清点点作作用用后后，，将将浸浸透透新新鲜鲜配配制制的的底底物物无无灰灰滤滤纸纸覆覆盖盖在在玻玻片片上上约约4-64-6minmin，，可可见见滤滤纸纸条条上上阳阳性性对对照照点点位位置置显显紫紫棕棕色色，，取取下下滤滤纸纸条条( (即即终终止止反反应应) )，，观观察察是是否否显显色色，，与与对对照照比比较较判判定定结果。

此法简便，并可保存实验记录此法简便，并可保存实验记录(4)CF试验试验 CF试验原来是立克次体病血清学诊断的试验原来是立克次体病血清学诊断的经典试验，虽然敏感性不如经典试验，虽然敏感性不如IFA和和 ELISA，，但非常特异一般在立克次体病发病一周内，但非常特异一般在立克次体病发病一周内，血清中即有血清中即有CF抗体出现，以后逐渐上升，抗体出现，以后逐渐上升，至第至第3周达最高峰，然后逐渐降至较低的效周达最高峰，然后逐渐降至较低的效价，并可保持几年不消失，但也有在病后几价，并可保持几年不消失，但也有在病后几周即转阴性者病人恢复期血清与斑疹伤寒周即转阴性者病人恢复期血清与斑疹伤寒群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳性结果，只能说明该群立克次体的感染性结果，只能说明该群立克次体的感染 三、恙虫病立克次体三、恙虫病立克次体 又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各组织器官的血管炎病变。

虫咬处溃疡形成黑组织器官的血管炎病变虫咬处溃疡形成黑色焦痂，周围有红晕等为其特征为自然疫色焦痂，周围有红晕等为其特征为自然疫源性疾病源性疾病(一一)微生物特性微生物特性1．具有多形性，但以短杆状为常见．具有多形性，但以短杆状为常见G-,姬姆姬姆 萨染色呈紫红色萨染色呈紫红色, Gimenez染色呈暗红色，染色呈暗红色， 背景为绿色可以鉴别恙虫病立克次体和背景为绿色可以鉴别恙虫病立克次体和 其他立克次体分布在细胞质内，密集于其他立克次体分布在细胞质内，密集于 细胞核旁细胞内寄生细胞核旁细胞内寄生2．培养特性培养特性(1)动动物物接接种种：：小小鼠鼠最最敏敏感感，，刮刮取取腹腹膜膜上上的的粘粘液液涂涂片片检检查查，，可可见见细细胞胞质质内内有有大大量量立立克克次次体体，，尤尤以以腹腹膜膜上上皮皮细细胞胞内内多多见见，，常常密密集集于细胞核旁于细胞核旁(2)细细胞胞培培养养：：恙恙虫虫病病立立克克次次体体可可以以在在多多种种细细胞胞内内生生长长、、繁繁殖殖，，多多采采用用Vero、、L929细细胞胞进进行行培培养养细细胞胞感感染染需需要要适适宜宜的的温温度度和和吸吸附附时时间间，，通通常常以以37℃吸吸附附1h，，培培养养32℃为为宜宜，，繁繁殖殖缓缓慢慢，，用用Vero细细胞胞培培养养8—9d，，在在细细胞胞质质内内生生长长繁繁殖殖，，在在细细胞胞核核旁旁高高度度密密集，但不侵入细胞核。

集，但不侵入细胞核3 3．抗原成分．抗原成分n恙恙虫虫病病立立克克次次体体具具有有耐耐热热性性多多糖糖抗抗原原和和特特异异性抗原n恙恙虫虫病病立立克克次次体体和和变变形形杆杆菌菌OXk株株有有共共同同的的抗抗原原成成分分，，在在Weil-Felex反反应应中中，，血血清清与与OX，，抗原发生凝集而不与抗原发生凝集而不与OX19、、OX2发生凝集发生凝集( (二二) )微生物检验微生物检验(1)抗抗原原检检测测：：ELISA间间接接法法是是检检测测标标本本的的特特异异性抗原或抗体的最常用方法性抗原或抗体的最常用方法2)PCR：：可可检检出出20ng恙恙虫虫病病立立克克次次体体DNA；；套套式式PCR法法可可检检出出200pg，，是是目目前前最最为为快快速速、、特特异异、、敏敏感感的的实实验验室室诊诊断断方方法法，，可可用用于于急急性性期期患患者的早期诊断者的早期诊断依据依据56KD蛋白抗原基因或蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因蛋白抗原基因序列选择引物，进行目的序列选择引物，进行目的 DNA 扩增，然后用扩增，然后用1．．5％琼脂糖电泳法检出特异性％琼脂糖电泳法检出特异性DNA带(3)分离培养分离培养 接接种种小小鼠鼠分分离离病病原原。

将将标标本本接接种种腹腹腔腔O．．5ml，，一一般般多多在在7～～18天天死死亡亡，，感感染染小小鼠鼠有有明明显显症症状状，，濒濒死死前前解解剖剖，，可可见见皮皮下下淋淋巴巴结结肿肿大大充充血血，，脾脾肿肿大大，，有有粘粘稠稠的的腹腹腔腔渗渗出出液液，，以以Giemsa染染色色镜镜检检，，在在靠靠近近细细胞胞核核旁旁边边可可见见成成堆堆排排列列的的立立克克次次体体也也可可接接种种Vero细细胞胞、、L929细细胞胞进进行行立立克克次次体体分分离离培培养养细细胞胞培培养养10—15天天，，取取细细胞胞涂涂片片，，Giemsa染染色镜检(4)抗体检测抗体检测n外外斐斐试试验验：：临临床床血血清清学学诊诊断断方方法法，，血血清清抗抗体体OXk效效价价达达l：：160以以上上有有意意义义，，病病程程中中双双份份或或多多份份血血清清试试验验，，若若效效价价有有4倍倍增增高高，，有有诊诊断断意意义义由由于于外外斐斐试试验验特特异异性性、、敏敏感感性性低低，，容容易易造造成成误误诊诊或或漏漏诊诊，，不不应应作作为为恙恙虫虫病的诊断方法病的诊断方法n免免疫疫荧荧光光试试验验：：快快速速敏敏感感特特异异，，可可分分别别检检测测患患者者血血清清中中的的抗抗恙恙虫虫病病立立克克次次体体lgG、、IgM抗抗体体，，效效价价在在1：：80以以上上有有诊诊断断意意义义。

双份血清有双份血清有4倍或以上增长可以确诊倍或以上增长可以确诊四、贝纳柯克斯体四、贝纳柯克斯体n又又称称Q Q热热立立克克次次体体，，是是引引起起Q Q热热( (疑疑问问热热，，指指最最初不明病因的发热初不明病因的发热) )的病原体的病原体n传传染染源源主主要要是是受受染染的的牛牛、、羊羊等等家家畜畜，，以以蜱蜱为为传传播播媒媒介介，，对对人人感感染染力力特特别别强强，，通通过过接接触触、、呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染nQ Q热热除除有有发发热热、、头头痛痛及及肌肌肉肉痛痛外外，，以以出出现现肺肺炎炎和肝炎为其临床特征和肝炎为其临床特征n慢性慢性Q Q热主要表现为心内膜炎热主要表现为心内膜炎 （一）微生物特性（一）微生物特性1.形形态态与与结结构构 个个体体较较小小，，多多为为短短杆杆状状，，常常排排列列成成对对，，Gimenez法法染染色色呈呈红红色色，，背背景景呈呈绿绿色色，，用用Giemsa法法染染色色呈呈紫紫红红色色有有荚荚膜膜，，在在鸡鸡胚胚卵黄囊或细胞培养内均可有芽胞形成卵黄囊或细胞培养内均可有芽胞形成2.基基因因组组与与抗抗原原成成分分 基基因因组组分分子子量量为为大大肠肠杆杆菌菌的的1／／3；；编编码码代代谢谢酶酶、、表表面面抗抗原原与与毒毒力力因因子子有有关关基基因因。

有有两两相相抗抗原原，，Ⅰ相相为为光光滑滑型型LPS，，Ⅱ相相为粗糙型短链为粗糙型短链LPS3．培养特点．培养特点鸡胚是培养的极好宿主一般经培养鸡胚是培养的极好宿主一般经培养10—12d，，1g卵黄囊膜常可获得约卵黄囊膜常可获得约1000μg纯净纯净的立克次体能在多种人和动物的原代或传的立克次体能在多种人和动物的原代或传代细胞内繁殖一般不引起明显的细胞病代细胞内繁殖一般不引起明显的细胞病变4．抵抗力．抵抗力n贝纳柯克斯体抵抗力强，贝纳柯克斯体抵抗力强，70℃ -90℃加热加热30—60min尚难杀死尚难杀死n1%福尔马林作用福尔马林作用24小时也不能完全灭活小时也不能完全灭活对氯霉素和四环素类抗生素敏感对氯霉素和四环素类抗生素敏感(二二)微生物检验微生物检验 (1)标本直接抗原检测：免疫荧光法进行检测标本直接抗原检测：免疫荧光法进行检测2)标标本本直直接接核核酸酸检检查查：：按按16SrRNA非非保保守守区区序序列列合合成成寡寡核核苷苷酸酸探探针针，，能能检检出出5pgrRNA，，如如将将非非保保守守区区特特异异性性扩扩增增，，其其敏敏感感性性可可达检出达检出1—10个贝纳柯克斯体的水平。

个贝纳柯克斯体的水平 用用贝贝纳纳柯柯克克斯斯休休质质粒粒DNA片片段段制制备备的的探探针针，，不不仅仅能能快快速速检检出出病病原原体体，，且且能能鉴鉴别别含含QpHI或或QpRS质质粒粒分分离离株株，，与与呼呼吸吸道道感感染染病病原原体体DNA无无交交叉叉反反应应试试验验仅仅需需8—12h即即可可得得到结果3．分离培养．分离培养n病原体分离只是在该地区尚未证明有病原体分离只是在该地区尚未证明有Q热存在，病情特别严重有必要将标本热存在，病情特别严重有必要将标本接种于豚鼠或培养细胞，观察其发病与接种于豚鼠或培养细胞，观察其发病与否或生长情况，经形态学、血清免疫学否或生长情况，经形态学、血清免疫学等鉴定后作出结论等鉴定后作出结论 4．抗体检测．抗体检测 用间接免疫荧光试验、用间接免疫荧光试验、ELISA和和CF试验 CF试验中抗原相的选择对结果影响极大，对试验中抗原相的选择对结果影响极大，对现症诊断主要看现症诊断主要看Ⅱ相抗体逐渐上升，若相抗体逐渐上升，若Ⅰ相抗相抗体保持较高水平，则往往说明慢性感染或隐体保持较高水平，则往往说明慢性感染或隐性感染 五、埃立克体五、埃立克体(一一)临床意义为埃立克体病病原体。

临床意义为埃立克体病病原体1.人腺热埃立克体病人腺热埃立克体病 可能由蜱传播，也可能由蜱传播，也 可能由于摄食生鱼引起临床表现为发可能由于摄食生鱼引起临床表现为发 热头痛、淋巴细胞数增加，并出现非典热头痛、淋巴细胞数增加，并出现非典 型淋巴细胞型淋巴细胞2.人单核细胞埃立克体人单核细胞埃立克体(HME)病，主要侵病，主要侵 染人的单核细胞和巨噬细胞传播媒介染人的单核细胞和巨噬细胞传播媒介 为蜱 3．人粒细胞埃立克体．人粒细胞埃立克体(HGE)病病 主要侵犯人主要侵犯人 粒细胞硬蜱是传播媒介也是莱姆病粒细胞硬蜱是传播媒介也是莱姆病 病原体的携带和传播者，故与莱姆病的病原体的携带和传播者，故与莱姆病的 相重叠 （二）微生物特性二）微生物特性1．为．为G-小球菌，呈多形性，小球菌，呈多形性，Romanows染染 色呈兰色和紫色吞噬细胞以内吞的方色呈兰色和紫色吞噬细胞以内吞的方 式将埃立克体摄入胞内，在胞质内以二式将埃立克体摄入胞内，在胞质内以二 分裂的方式繁殖，形成包涵体称为桑分裂的方式繁殖，形成包涵体。

称为桑 椹体2．基因组．基因组 埃立克体的埃立克体的16SrRNA基因极保守，基因极保守， 但但5’端的端的50—100碱基为高变区，适合设计碱基为高变区，适合设计 PCR引物或核酸杂交探针人粒细胞埃立引物或核酸杂交探针人粒细胞埃立 克体的外膜蛋白克体的外膜蛋白44kDa蛋白被克隆，可用蛋白被克隆，可用 作探针3．抗原成分．抗原成分 在埃立克体属内的各种埃立克在埃立克体属内的各种埃立克 体均可有血清学交叉反应体均可有血清学交叉反应 (三三)微生物检验微生物检验 1.标本直接显微镜检查标本直接显微镜检查 采采集集病病人人的的外外周周血血制制备备血血片片，，经经Giemsa或或Wright染染色色，，在在光光镜镜下下发发现现粒粒细细胞胞及及单单核核细细胞胞质质或或血血小小板板内内有有圆圆形形、、深深紫紫色色的的桑桑椹椹体体，，可可作作为为急急性性期期埃埃立立克克体体病病的的一种简便和有效的辅助诊断方法一种简便和有效的辅助诊断方法2.核酸检测核酸检测 PCR是最有效的埃立克体病的病原学诊断方是最有效的埃立克体病的病原学诊断方法，可用于埃立克体病的早期诊断。

大约法，可用于埃立克体病的早期诊断大约80％％-87％％HME和和43％％-75％的％的HGE患者的血标患者的血标本被本被PCR检测为阳性检测为阳性 特异性几乎为特异性几乎为100％，主要依赖引物的特异性％，主要依赖引物的特异性可用可用16SrRNA基因设计引物或做基因探针基因设计引物或做基因探针有极高的敏感性，感染后数天就可检出阳性有极高的敏感性，感染后数天就可检出阳性结果 3.细胞培养细胞培养n查查菲菲埃埃立立克克体体可可用用犬犬巨巨噬噬细细胞胞系系(DH82)，，腺腺热热埃埃立立克克体体用用小小鼠鼠的的巨巨噬噬细细胞胞系系(P388D1)，，人人粒粒细细胞胞埃埃立立克克体体则则用用人人的的粒粒细细胞胞白白血血病病细细胞系胞系(HL-60)作它们的体外培养的宿主细胞作它们的体外培养的宿主细胞n将将3ml抗抗凝凝血血的的白白细细胞胞层层，，接接种种细细胞胞单单层层，，置置 37℃的的5％％C02孵孵育育箱箱中中培培养养，，每每隔隔3-4天天换换一一次次细细胞胞维维持持液液，，并并刮刮少少许许细细胞胞涂涂片片，，用用Giemsa染色，在光镜下检查埃立克体包涵体染色，在光镜下检查埃立克体包涵体。

4.小鼠接种小鼠接种 从蜱体内分离埃立克体让蜱叮咬小鼠和吸血从蜱体内分离埃立克体让蜱叮咬小鼠和吸血或将病人或动物的抗凝血的白细胞注入小鼠或将病人或动物的抗凝血的白细胞注入小鼠腹腔观察小鼠发病观察小鼠发病 定时采小鼠血作涂片染色、定时采小鼠血作涂片染色、IFA、、PCR等证明等证明小鼠被埃立克体感染，用腹腔液涂片染色镜小鼠被埃立克体感染，用腹腔液涂片染色镜检包涵体检包涵体 5.抗体检测抗体检测(1)间接免疫荧光间接免疫荧光(1FA)：： 将感染血清作倍比稀释，加入抗原孔内，将感染血清作倍比稀释，加入抗原孔内， 置湿盒置湿盒37℃孵育孵育lh；；玻片冲洗后，用玻片冲洗后，用 Evans蓝作背景染色，然后每孔加一滴固蓝作背景染色，然后每孔加一滴固 定液，加盖玻片，在荧光显微镜下检查感定液，加盖玻片，在荧光显微镜下检查感 染细胞内的带荧光的包涵体，通常血清中染细胞内的带荧光的包涵体，通常血清中 抗体滴度抗体滴度 1：：20为阳性若获双份血清效为阳性若获双份血清效 价增高价增高4倍以上即可明确诊断倍以上即可明确诊断(2)(2)免疫印迹免疫印迹 采采用用免免疫疫印印迹迹检检测测埃埃立立克克体体病病患患者者血血清清 中中抗抗埃埃立立克克体体主主要要抗抗原原组组分分的的抗抗体体，，可可 以以改改善善血血清清学学检检测测的的特特异异性性。

经经免免疫疫印印 迹迹分分析析发发现现H HM ME E患患者者血血清清中中含含有有抗抗查查菲菲 埃埃立立克克体体的的4 44 4k kD Da a抗抗原原组组分分的的I Ig gG G抗抗体体 但但不能用于埃立克体病的早期诊断不能用于埃立克体病的早期诊断 六、汉赛巴通体六、汉赛巴通体 n引引起起杆杆菌菌性性血血管管瘤瘤—杆杆菌菌性性紫紫癜癜(BAP)和和猫猫抓抓病病(CSD)的的病病原原体体常常在在免免疫疫缺缺陷陷病病毒毒(HIV)感感染染者者发发生生，，也也感感染染有有免免疫疫潜潜能能的的人人群群，，与与接接触触猫猫有有关关为为G-营营养养要要求求苛刻的需氧杆菌，为兼性胞内寄生菌苛刻的需氧杆菌，为兼性胞内寄生菌n猫猫抓抓病病有有与与猫猫接接触触史史，，抓抓咬咬部部位位形形成成丘丘疹疹脓脓疱疱，，继继而而出出现现淋淋巴巴结结肿肿大大，，约约10％％病病例例有有肉肉芽芽肿肿性性结结膜膜炎炎、、骨骨质质溶溶解解、、肺肺炎及中枢神经系统损害等炎及中枢神经系统损害等杆菌性血管瘤杆菌性血管瘤- -杆菌性紫癜杆菌性紫癜n常常在在免免疫疫低低下下者者发发生生与与猫猫抓抓伤伤咬咬伤伤有有关关，，主主要要表表现现为为皮皮肤肤损损害害和和内内脏脏发发生生紫紫癜癜。

在在病病变变处处能能发发现现杆杆菌菌状状小小体体开开始始皮皮肤肤出出现现红丘疹，偶有溃疡皮下出现肉色结节红丘疹，偶有溃疡皮下出现肉色结节n杆杆菌菌性性血血管管瘤瘤可可发发生生在在任任何何实实质质性性器器官官，，很很难难与与分分枝枝杆杆菌菌和和真真菌菌感感染染或或恶恶性性肿肿瘤瘤鉴鉴别(一一)微生物特性微生物特性1．．为为G-弯曲的杆状小体，常呈多形性；初弯曲的杆状小体，常呈多形性；初 分离有菌毛，发现有噬菌体分离有菌毛，发现有噬菌体2．培养特性．培养特性 营养要求苛刻的需氧杆菌，用营养要求苛刻的需氧杆菌，用 含新鲜血的琼脂或脑心浸液于含新鲜血的琼脂或脑心浸液于35℃5％％ C02环境下培养环境下培养2—5周才长出灰色凸起周才长出灰色凸起 并嵌入琼脂内的菌落并嵌入琼脂内的菌落3．基因组．基因组 约为约为2005kb已经测序的基因已经测序的基因 有有16SrRNA和和 glt A基因序列包括基因序列包括1293 核苷酸，始于核苷酸，始于ATG起始密码子，终于起始密码子，终于 两两TAA终止密码子终止密码子(二二)微生物检验微生物检验1. 标本染色直接检查标本染色直接检查 活检病理标本和淋巴结活检用活检病理标本和淋巴结活检用Warthin- Starry染色能查见多形性菌体。

染色能查见多形性菌体2. 核酸检测核酸检测 依依16S rRNA或或gltA基因设计引物，对临床标基因设计引物，对临床标 本作本作 PCR，，其扩增产物经序列测定或用特异其扩增产物经序列测定或用特异 性性DNA探针鉴定，可直接作出病原诊断探针鉴定，可直接作出病原诊断 3.分离培养分离培养可将血液标本先经溶血和离心处理，待长出可将血液标本先经溶血和离心处理，待长出菌落后作生化反应，分析其细胞脂肪酸和菌落后作生化反应，分析其细胞脂肪酸和16SrRNA序列等加以鉴定于培养序列等加以鉴定于培养1周仍不见生周仍不见生长，应继续培养至长，应继续培养至4周 4.抗体检测抗体检测(1)IFA：：双双份份血血清清滴滴度度呈呈4倍倍增增长长为为阳阳性性；；单单份份 血清滴度至少达血清滴度至少达1：：64方可考虑诊断方可考虑诊断2)ELISA：：用用 17KD重组体抗原作重组体抗原作 ELISA检测检测 人血清抗体人血清抗体IgG，，有助于诊断有助于诊断3)免疫印迹试验：可显示免疫印迹试验：可显示 48．．5kDa 蛋白质组蛋白质组 分，而非巴通体感染病人血清则不能与此蛋分，而非巴通体感染病人血清则不能与此蛋 白组分反应，以此作为确证试验。

白组分反应，以此作为确证试验。