细胞分选技术.ppt

StemCell Technologies Inc. 细胞分选产品细胞分选和基本原理• 细胞分选是把一种细胞从多细胞样品中分 离出来 • 用抗体标记细胞，同时被用的抗体被萤光 标记或连接免疫磁珠或其它 • 利用萤光和免疫磁珠的特性来分离细胞细胞分选常用方法• 密度梯度离心(Ficoll)离心• 抗体标记分离 • 免疫密度离心 • 免疫磁珠 • 流式正选 和 负选正选需要得细胞标记需要得细胞需要得细胞标记不需要得细胞负选正选• 只需要一种抗体• 分离出的细胞纯度高• 对于比例小的细胞群，正选容 易得到高纯度正选和负选的比较优点负选• 需要的细胞没有被抗体等标记• 对需要的细胞，不需要特异性的 细胞标记缺点• 需要多种抗体标记不需要的 细胞• 需要特异性的靶细胞标记• 可能引起细胞活化细胞分选产品StemCell Technologies Inc. 的细胞分选原理• 利用抗体四聚体(Tetrameric Antibody Complex, TAC)来分选细胞 TACCell磁珠直接标记TACCell磁珠间接标记• 适用于人的全血细胞样品 • 是一种负选方法 • 基本原理：抗体标记和免疫密度离心 法 • 需要的仪器：离心机Direct Labeling of Human Cells不需要的细胞离心把细胞样品置于 密度分离液上分选的过程标记把RosetteSep™ 抗 体混合液加入细胞 样品中室温下 20分钟用缓冲液 稀释收集的密度分离液DM-L• 为了最大限度回收淋巴细胞，StemCell专门研制 了一种适合RosetteSep™的密度分离液—— DM-L • DM-L 的密度：1.081 g / mL • DM-L 的渗透压与人外周血的渗透压相同(iso- osmolar) • 适用于以下的淋巴细胞分选: –CD3+ T cells -CD8+ T cells –CD4+ T cells -B cellsDensity of Fresh LeukocytesFrom: “Centrifugation Techniques III”, Nycomed Amersham Monocytes Lymphocytes Basophils Neutrophils Eosinophils Erythrocytes1.0601.0701.0801.0901.100 Density in g/mLDM-L: 1.081 g/mL Ficoll: 1.077 g/mL低温冷藏的外周 血单个核细胞人 和 小鼠脾细胞• 负选, 只需要离心机 • 可以同时分选多份样品 –取决于离心机的容量• 分选的细胞量在 –106 cells in Eppendorf - 109 cells in 50 mL tube • 适用于低温冷藏的人外周血单个核细胞(PBMC) 和小鼠脾细胞的特点 Sep直接标记人的细胞Anti-cell Anti- particle Tetrameric Antibody Complex (TAC)Dense Particle(1mm)Unwanted Cell间接标记小鼠的细胞 Tetrameric Antibody Complex (TAC)Biotinylated AntibodyAnti- Anti- Biotin ParticleDense Particle(1mm)Unwanted CellSpinSep 的分选过程Label Layer 效果-分选的细胞纯度高• 易：操作过程简单易行 • 广：可做正选和负选 • 适应性强：在理论上可以分选任何一种细胞Anti- Anti-Cell ParticleTetrameric Antibody Complex (TAC)Magnetic Nanoparticle (160 nm)直接标记人的细胞CellMagnetic Nanoparticle (160 nm)Tetrameric Antibody Complex (TAC)Biotin/Fluo Antibody Anti- Anti- biotin/Fluo Particle 间接标记小鼠细胞CellRelative Sizes of Magnetic Particles used in Cell SeparationCell的细胞分选过程• Ab (TAC) (人)• Abbiotinanti-biotin TAC(小鼠)标记放置磁极中 倒出未标记的细胞分选结合磁珠加入免疫磁珠 孵育后稀释正选资料人的外周血细胞(PBMC)小鼠脾或骨髓细胞负选资料人的外周血细胞(PBMC)小鼠脾细胞可正选或去除任何一种细胞• PE 标记的抗体分选Kit • FITC 标记的抗体分选Kit • Biotin 标记的抗体分选KitCell细胞分选常见的问题分选方法的选择 • 样品种类 • 样品数量 • 每次需要分选的细胞数常见问题样品的前处理 • Ficoll• 离心机 • 全血和单采的细胞• 细胞计数 • 稀释液 • 细胞数常见问题分选过程中 • 细胞浓度 • 缓冲液 • 细胞混匀动作要点Calculating Purity and Recovery% Purity=# desired cells in enriched fraction x 100 # total nucleated cells in enriched fraction=% of total events in the desired cell gate (FACS profile)% Recovery =# desired cells in enriched fraction x 100 # desired cells in start=(% purity in enriched) x (total nucleated cells in enriched) x 100 (% purity in start) x (total nucleated cells in start)FACS GatepanNK+ Selected from Mo SpleenStartNK+ SelectedData analysis的技术要领• 细胞稀释后，用吸管混匀细胞（不要倒置试管 ）• 倒出未标记的细胞时，让液体连续流淌，试管 停留在最后的位置约2秒钟，但不要刻意抖下最 后一滴细胞液Product Information Available• • 杭州百通生物技术有限公司 • Catalogue • Combined Procedure / PIS / Product Profile • Technical Bulletins。