组培常见问题.docx

植物组培过程中污染产生的原因及防治措施一、 污染的原因   污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象组织培养中污染是经常发生的，常见的污染病原是细菌和真菌两大类细菌污染常在接种1-2d后表现，培养基表面出现黏液状菌斑真菌污染一般在接种后3d以后才表现，主要症状时培养基上出现绒毛状菌丝，然后形成不同颜色的孢子层   造成污染的原因也很多，主要有    (1)  培养基及各种使用器具灭菌不彻底   (2)  外植体消毒不彻底   (3)  接种时不严格无菌操作   (4)  接种和培养环境不清洁   (5)  培养容器原因，包括盖子和封口膜等二、 材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染，操作人员不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染2 污染的预防措施    2.1灭菌要彻底   在组培生产中，各种培养基以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌首先是培养基的灭菌，耐高温的培养基需要在121-123℃条件下灭菌20-30min。

若出现灭菌时间不足或温度不够，培养一段时间后就会在培养基表面产生细菌性的污染一些不耐高温的物质，可采取细菌过滤器除去其中的微生物其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染第三，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗    2.2环境消毒   不清洁的环境也会使培养的污染率明显增加，尤其是在夏季，高温高湿条件下污染率更高接种和培养环境要保持清洁，定期进行熏蒸或喷雾消毒高锰酸钾和甲醛熏蒸效果好，但对人体有一定的伤害，一般每年熏蒸2-3次平时读接种室和培养室可采用紫外线照射消毒或喷2%来苏尔消毒臭氧消毒机对环境消毒效果较好，而且使用灵活方便，对人体的伤害也相对较小   2.3严格无菌操作   在接种时要严格无菌操作，避免人为因素造成污染为了使超净工作台有效工作，防止操作区域本身带菌，要定期读一过滤器进行清洗和更换对内部的过滤器，不必经常更换，但每隔一定时间要检测操作区的带菌量，如果发现过滤器失败，则要整块更换此外还需要测定操作区的风速，通过调压旋钮使操作区的风速达到无菌操作需要的20-30m/min。

植物组培过程中培养物的玻璃化及其防治方法    当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，苗体趋于透明，其茎、叶表面无蜡质，这种现象通常称为玻璃化玻璃化为组培苗的生理失调症，它的出现会使组培苗生长 缓慢、繁殖系数有所下降，玻璃化的嫩茎不宜诱导生根   1 导致玻璃化的主要因素：   ① 材料差异，在不同的种类、品种间，组培苗的玻璃化程度有所差异   ② 激素水平过高,若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，易引起玻璃化现象   ③ 培养基水势，培养基中离子种类,比例不适   ④ 环境温度、光照强度和通气性温度过低或过高,光照时间强度不足及培养容器中空气湿度过高，透气性较差所造成的通气不良,易造成组培苗含水量高,从而发生玻璃化现象   ⑤ 琼脂浓度降低、有杂质等     2 常用的防治措施有    ① 增加光照强度和光照时数   ② 降低细胞分裂素含量在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落 酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生   ③ 增大培养基中琼脂的含量，以降低培养基的水势   ④ 降低NH4+浓度，减少培养基中含氮化合物的用量   ⑤ 增加容器通风，最好进行 CO2施肥，这对减轻组培苗玻璃化的现象有明显的作用；   降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻组培苗玻璃化的现象发生；组培苗瘦弱或徒长的防治措施     正常的组培苗应当叶色浓绿、植株粗壮。

如果在增殖阶段出现芽苗瘦弱、徒长或节间过长，这种苗转入生根培养时能够生根，在环境条件较好的情况下，也会稍转粗壮，但总体看来，苗的株型、叶色、叶片大小等性状还是差于生长正常的增殖苗；有时即便是正常或健壮的增殖苗，若生根阶段培养基不适宜或培养的环境条件得不到保障，往往根原基及根还未形成，就很快表现出小苗徒长，节间明显伸长，叶片变细、变薄、变嫩并出现黄化这样的苗进行过渡培养时，会出现萎蔫和烂根，很容易死亡，过渡成活率极低  对组培苗瘦弱的原因分析如下    (1)细胞分裂素浓度过高，产生了过多的不定芽，这些密集的芽若不及时进行转移和分切，很快就开始变成瘦弱苗 (2)温度过高，高温有利于苗的生长，多数品种适宜的温度是25℃左右，在过高的温度条件下，苗木的伸长速度快，叶片变薄、变长 (3)光照不足，组培苗会变黄、变弱、变细并加速生长，使苗在短时间内变得更瘦弱 (4)培养基水分过多，在琼脂含量不足会引起植株徒长变弱    (5)通气不良，在使用不透气膜时，会增加瓶内湿度，从而使苗表现嫩弱 以上因素同时出现时，对苗的不良影响明显大于单一因素，各个因素之间相互促进又相互制约。

因此控制瘦弱苗，培养粗壮苗应通过多个因素共同调节才可能获得理想的效果 减少和避免徒长和瘦弱苗的产生，可从以下几个方面考虑 (1)根据品种特点减少细胞分裂素用量，加速继代转瓶的速度，适当降低接种密度 (2)利用空调降低培养室温度3)提高光照强度和延长光照时间，充分利用较强的自然光做光源，调整摆放位置和密度4)调整培养基硬度，改用透气膜做封口，进行培养基及环境因子的综合调控，力求获得最优质健壮的组培瓶苗植物组织培养技术原理之灭菌方法常用的灭菌方法： 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理1、湿热灭菌（培养基）  培养基在制备后的24h内完成灭菌工序高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀关阀再通电后，压力表上升达到0．1MPa时压力0．1-0．15MPa，20min 对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%   防止高压灭菌培养基变化的方法：(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，及时采取有效措施2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序如将磷、钙和铁放在最后加入。

4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48而96h后又回降至5.8左右      2、灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌冷却后，立即使用操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具     3、紫外线和熏蒸灭菌（空间）(1)紫外线灭菌  在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜     (2)熏蒸灭菌  用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可     常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。

冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛    4、喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌褐变和玻璃化1、初代培养外植体的褐变  外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养 褐变的主要原因:①植物品种:研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的由于多酚氧化酶活性上的差异②生理状态:由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重③培养基成分：浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深④培养条件不当：如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度减轻褐变现象发生的方法①选择合适的外植体  一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。

②合适的培养条件  无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象③使用抗氧化剂  在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果④连续转移  对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻 2、继代培养时材料的玻璃化实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；②减少培养基中含氮化合物的用量；③增加光照；④增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；⑤降低培养温度，进行变温培养。