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细胞转染讨论细胞转染讨论 最好同时设计几对，选择效果较好的，别忘了做对照（GFP）,排除非特异性干预1.不同的细胞及转染试剂对于质粒和脂质体的比例要求是不同的，所以在正式实验前必须摸索一个最佳转染比例总的来说，细胞系较原代好转，脂质体的用量以说明书为参考上下浮动 2.对于转染后的效应检测，体外直接合成的 SiRNA 多半在 48h 检测，也有 72H 的，但时间再长有可能降解而失去功效对于用 U6 或 H1 质粒载体体内转录生成 siRNA 的，因为有一个转录时间，所以检测可以稍靠后；而且，与体外合成的相比，虽然载体也不能大量整合到细胞基因组中，但毕竟不会马上降解，Knockdown 的时间效应相对要长，一般一周左右没有问题所以可以在检测时做一个时间梯度，使实验数据更加丰满完善一些但要考虑靶细胞生长特性，疯长的可能效果较差）一般在转染后 4－6 小时补加血清，可以就在你原来的无血清培养基中滴两滴血清如果你觉得 LF2000 可能对你的细胞有毒性作用的话（一般LF2000 的毒性不至于很大，可以不用更换培养基，具体看你细胞的生成状态了），你可以把原来的无血清培养基吸出来，更换成含血清的培养基。

在转染后的 4－6 小时，最好不要动你的细胞，让它安静地躺着，因为此时细胞最为脆弱，不合适的动荡会使其死亡率增加lipofectamine2000 转染后在 6 小时左右最好换液且换为有血清的血清，其一因为 lipofectamine2000 对细胞的毒性作用还是有的，其二可降低因血清的缺乏引起的细胞的死亡转染时不加血清是防止血清的干扰作用，转染后可适时加入加入过早会引起未转染细胞的优势生长，过晚会引起较多细胞死亡可时时观察 1/5 细胞变圆的时候加入血清转染全程都不应加有抗生素的，我刚刚做完 LP2000 转染的，把我的一点经验告诉你啊： 1.加完脂质体 DNA 混合物后细胞就出现小黑点，这很正常的，因为 LP2000 即使毒性再小它也是有毒性的，减轻的办法就是 4－5 小时把混合物去掉换有血清的新培养基培养，我做之前看有些战友的意见毒性大 3 小时换也行的 2.我的是在无血清的 DMEM 下转的，推荐买 OPTI-MEM，但到货一个月，我也没用，不过还可以的 3.多摸几个浓度比例，找出最适合的，如果有报告基因就最好了，但是我的也没有 4.细胞密度要够哇，80％左右吧，我感觉细胞死的还挺多的。

5.按照 LP2000 操作说明来做，基本上没问题的 6.这个我应该建议你在做之前搜索本版，好好看看战友的经验，绝对受益匪浅啊RT-PCR 检测转染提取 RNA 中混杂有少量质粒 DNA 会出现 RT-PCR 假阳性 排除方法：设一阴性对照，用提取的 RNA（不经 RT）直接作模板进行 PCR 扩增我准备研究某基因功能，构建了重组表达质粒（以荧光素酶为报告).现准备转染细胞，并以不含目的基因的质粒作对照请问： 1.如果以 beta-gal 质粒共转染作内参，荧光素酶活性如何校正？ 2.如果以 beta-gal 质粒共转染作内参，各种条件转染需作复孔吗？ 3.各种条件转染均作复孔，结果经统计学处理，目的是排除孔间转染效率差异是否还需要作共转染内参照？为了简便，大多数的研究者，如楼上所说，把 LUCIFERASE 的活性值除以 beta-gal 的值就行了但理论上讲是应该将内源性的 beta-Gal 活性扣除的，对于哺乳细胞，内部是有此酶活性表达的所以，要设一个孔，任何 DNA 都不转染，然后把所有的 beta-gal 活性值都减去这个阴性对照的数值，最后把这个值与 LUCIFERASE 的活性做比，求出的比值为 LUCIFERASE 基因前面 PROMOTER 的活性。

PROMEGA 有一种试剂盒，做内参照的不用 beta-gal,是另一种 LUCIFERASE，用不同的底物这种酶在细胞内没有内源性的表达，结果更可靠些 这个 beta-gal 一定要加，因为它是衡量转染效率的它可是告诉你，是十个 DNA 转进去了，还是一百个如果没有这个衡量标准，转进去了一百个 DNA 的 LUCI 活性当然强，如果跟转进去十个的比高不了多少，那事实上 LUCI 前的 PROMOTER 活性还是低如果没有这个标准就会得出错误的结论了 减去背景 beta-Gal 的时候不可直接减，要换成（活性/毫克）再减，这样相当于每个细胞里减去背景同样的道理，做比值的时候也要把 A 值换成（活性/毫克）再与 beta-Gal 比 不知说明白了没有总之感觉处理数据很困难总体的趋势应该和两值直接比差别不大（在背景比较小的时候有的细胞背景就是高）有两种可能，一是 LIPO 对你的细胞毒性大，解决方法是五小时转染完成后，把转染混合液吸出，再加培养液二是该细胞对你转染进去的质粒表达产物敏感，或是被诱导了 APOPTOSIS，或是造成了 DIFFERENTIATION，解决方法是换一种细胞，看这种现象是否发生MTT 检测的是细胞的活性,即活细胞数的相对量,不可能用来检测转染效率.MTT 检测最后细胞都碎裂,如何继续培养.可做三个平行孔,分别 24.48 72 小时检测. 想做 Western 和，RT-PCR 和流式的话，如果这些孔转染相同的质粒,当然可从其中几个孔的细胞做 Western,再取另外几个孔的细胞作 RT-PCR，再取别的孔的细胞作流式？其实瞬转质粒的效果都不好,建议还是做稳定表达.可考虑以下原因： 1.培养基必须在转染 24 小时前换用无双抗的。

2.质粒虽然是按说明书提取的，但要看清楚质粒提取试剂盒是否可以去除内毒素3.如果选用 Invitrogen Lipofectamine 2000，它提供的参考步骤并不一定是你选用的培养板规格，须参照后面的列表． 4.培养板非常容易污染，必须排除微生物污染的可能． 5.可以考虑转染 5 小时左右吸去转染液体，换用含血清的培养基继续培养． 6.转染前你培养了多少时间？如果进行顺式转染，必须在细胞生长达到７０－８０％再进行转染个人认为你还可以考虑以下方面： 1.请确认你的 Lipofectamine 2000 是否已经过期，经过我们实验室的实践：尽量使用开封半年内的Lipofectamine 2000，因为过了半年后，就算没有过失效期，但是细胞毒性大大增加，而转染效率却大大下降 2.确认你在使用 Promega 质粒提取试剂盒是使用了内毒素去除树脂（Endotoxin Removal Resin） 3.按照 Promega 质粒提取试剂盒的 protocol，在第 19 步加入 nuclease-free water 后直接放入-20 或-80 度冻存就可以，我们没有另外沉淀 4.去除质粒提取中的酒精可以试用下面的方法：将 Ep 管倒置在灭菌的滤纸上，大概 10-20 分钟后就可以干了，注意不要时间过长，否则太干了，不太好溶解。

5.你可以尝试适当减低转染试剂的用量，并在转染 5 小时时观察细胞情况，并且换 10％FBS 的培养基，看看情况怎么样，因为转染液对细胞的损伤非常大 祝您实验成功！各种培养细胞或细胞株对转染试剂的毒性敏感程度不一样, 脂质体的毒性大一些, 如果是转染试剂的问题,建议使用毒性低一些的转染试剂,如阳离子聚合物转染试剂，可以试试梭华-sofast 1.高质量的 siRNA（或者是 siRNA 表达工具，比如质粒，PCR 片断等） 2.有效的转染试剂 如何选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子常见的转染试剂包括脂质体和多胺类的试剂，主要是为双链 DNA 转染而设计的转染质粒 DNA 的最佳试剂往往不适合 siRNA 的转染，反之亦然适合于质粒 DNA 转染用的转染试剂往往也不适合 siRNA表达框（SECs: PCR fragments expressing siRNAs，参考 RNAi：制备 siRNAs 的 5 种方法——如何选择最适合你的方法）的转染随着 RNAi 技术越来越受重视，各厂家纷纷推出了自己的 RNAi 转染试剂 一：siRNA 专用转染试剂 （二：质粒和 PCR 片断专用转染试剂） 产品名：RNAiFect Transfection Reagent 厂家：Qiagen 优点：高效低毒；适用细胞广泛；即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染，操作格外简单方便 简介：siRNA 的转染是基因沉默实验中关键的一步。

RNAiFect 是一种基于脂质的转染试剂，专门用于 siRNA 转染，确保没有 RNAse 活性传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素由于 RNAiFect 的内毒素和细胞毒性都非常之低，加上转染复合物能够高效的在完全培养基中形成，因而整个转染过程可以在含血清而且是含有抗生素的培养基中操作，无需更换培养基，这极大的方便转染操作！该试剂可以耐受较高浓度的 siRNA 转染而不引起细胞毒性，能够得到更好的抑制效果，适用于包括 AGS, HEK-293, HeLaS3, Huh-7, HUVEC, NIH-3T3, and mouse embryonic fibroblasts cells 在内的多种真核细胞 操作流程： 1.用含有抗生素和血清的培养基，或者是附带的 Buffer EC-R 稀释 siRNA 2.加入 RNAiFect 转染试剂，在室温下混合并孵育 10—15 分钟 3.加入培养细胞中即可24—48 小时后检测 siRNA 的干扰效果 参考数据： HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6 x 104 cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturer’s protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit with primers targeted to lamin A/C and GAPDH. Expression of the lamin A/C gene was normalized to the expression of GAPDH and quantified using a standard curve prepared from known amounts of cDNA purified from HeLa-S3 cells. Cells were transfected and LDH activity in the cell culture supernatants was tested 48 hours later, using a colorimetric assay according to the manufacturer’sprotocol. LDH activity in the cell culture supernatant of untransfected cells lysed by detergent was set to 100%. Background LDH activity w。