新型人转录因子hBKLF对K562细胞增殖、分化及血红蛋白合成作用的研究.doc

1新型人转录因子 hBKLF 对 K562 细胞增殖、分化及血红蛋白合成作用的研究作者：王茫桔　 马晓芸 　石永进　 武淑兰　 贺福初 【摘要 】 　　孕 22 周的胎肝是胎儿的主要造血器官，其中含有大量与造血相关的调控因子人碱性 Krüppel 样因子(human basic Krüppel- like factor,hBKLF)是本研究室从这一时期胎肝 cDNA 文库中新克隆的转录因子对其 C 端的结构分析发现，它含有 3 个特征性 C2H2 锌指结构，因此属于 KLF 转录因子家族前期的表达谱研究工作显示，hBKLF 在成人外周血白细胞、骨髓和胎肝中表达量高，在红系中有表达，这提示它可能与造血相关本研究以 K562细胞为模型，研究 hBKLF 与造血细胞增殖、分化及血红蛋白合成的关系构建 hBKLF 正义及反义真核表达载体，转染 K562 细胞，经G418 筛选 4 周，得到稳定细胞株；用 RT- PCR、Western blot 方法测定转染后 K562 细胞 hBKLF 表达水平的变化；以转染空质粒的K562 细胞为对照组，在显微镜下直接观察转染正义质粒和反义质粒的两组细胞形态的改变；用 MTT 法比较增殖速率的变化；用甲基纤维素半固体培养法比较集落形成率的差别；用苯息丁法观察氯高铁血红素（hemin）诱导 K562 细胞分化后血红蛋白合成水平的差异。

结果表明：正义质粒和反义质粒经 NcoI 酶切鉴定构建正确转染2正义质粒的 K562 细胞（正义组）中 hBKLF 的 mRNA 及蛋白质表达水平增加，转染反义质粒的 K562 细胞（反义组）中 hBKLF 的mRNA 水平降低增殖活性在反义组、正义组、对照组分别为1.335±0.022、1.067±0.010、1.118±0.014，反义组 K562 细胞的增殖速率加快，正义组细胞增殖速率减慢（P<0.001 ） 细胞形态在各组间无明显区别集落形成率在反义组、正义组、对照组分别为 148±13、136±10、141±10，各组间无显著差异（P>0.05） 3 组细胞血红蛋白合成水平在 hemin 诱导后均升高，诱导后血红蛋白升高倍数在对照组、反义组、正义组分别为9.064±1.637、14.360±2.185、4.820±0.404，反义组 K562 细胞合成血红蛋白能力增加，正义组合成血红蛋白能力下降（P<0.05） 结论： hBKLF 可以抑制 K562 细胞的增殖，对血红蛋白合成有负调控作用，但未观察到 hBKLF 对细胞形态及克隆形成率的影响 【关键词】 hBKLF 血红蛋白; K562; 细胞增殖; 细胞分化Effect of the New Human Transcription Factor hBKLF on the Prolifera-tion, Differentiation of K562 Cell Line and Hemoglobin SynthesisDepartment of Hematology, Peking University First 3Hospital, Beijing 100034, China; 1Department of Genomics and Proteomics, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Chinese National Human Genome Center at Beijing, Beijing 100850, China Abstract The human basic Krüppel-like factor （hBKLF） is a newly cloned human transcription factor from the cDNA library of fetal liver. It belongs to the Krüppel- like transcription factor family. Previous expression study showed that it is a hematopoietic related factor. This study was aimed to investigate the effect of hBKLF on cell proliferation, differentiation and hemoglobin synthesis by using K562 cell line as model. The sense and antisense expression plasmids of hBKLF were constructed, and transfected into K562 cells by lipofectamine. After G418 selection for 4 weeks, the cell line with stable expression of the gene was obtained. Then the hBKLF expression level, proliferation ability, colony formation and hemoglobin production were detected by RT-PCR and Western blot, MTT method, methyl cellulose semisolid culture method and benzidine test respectively. The morphologic change of cell was observed with inverted microscope. The results showed that the sense plasmid could increase hBKLF level and antisense plasmid could decrease hBKLF expression. 4When hBKLF level was down-regulated, K562 cells could proliferate more quickly and synthesize more hemoglobin. But there were no differences in colony formation ability and no apparent morphologic change.It is concluded that hBKLF can inhibit hematopoietic cell proliferation and hemoglobin synthesis. It is suggested that hBKLFplays an important role in the proliferation and differentiation of hematopoietic cells.Key wordshBKLF; hemoglobin; K562; cell proliferation; cell differentiation人碱性 Krüppel 样因子（human basic Krüppel- like factor， hBKLF)是我室近年从人胎肝 cDNA 文库中克隆的新型转录因子［1］ ，其 N 端含 3 个连续的 C2H2 锌指结构，这是 KLF 转录因子家族的共同特征［2］ ，因此 hBKLF 是 KLF 家族的新成员。

这一家族的成员还有 EKLF［3］ 、GKLF［4］ 、LKLF ［5］ ，IKLF［6］等已知 EKLF 特异地调控 β 珠蛋白的表达；GKLF、IKLF 与细胞的增殖、分化有关；LKLF 与 T 细胞的活化、记忆有关,但 hBKLF 的功能尚不清楚我室前期对 hBKLF 在人类胎儿组织、成人组织、造血细胞中的表达谱研究提示，hBKLF 可能与造血相关本研究试图以 K562 细胞为模型，研究 hBKLF 与造血细胞5增殖、分化及血红蛋白合成的关系材料和方法细胞系、菌株、质粒及试剂人胎肝 cDNA 文库、K562 细胞、COS-7 细胞、JM109 大肠杆菌、pcDNA3.1/myc-his C 质粒为我室保存 Wizard PCR 产物回收试剂盒、Wizard 质粒纯化试剂盒、 AMV 高效逆转录试剂盒均购自 Promega 公司小牛血清、胎牛血清购自 Hyclone 公司RPMI 1640 购自 Gibco 公司G418、MTT、Hemin 购自 Sigma公司Lipofectamine 购自 Life technologies 公司2.7%甲基纤维素由北大医院血液科提供，1% 苯息丁由军事医学科学院九所提供。

质粒构建hBKLF 正义引物 P1：5′-CAGAAGCTTACTAAA AGAATGCTCATGT-3′ ，P2：5′-ACTCTCGACTGA CTAGCATGTGGCG-3′反义引物：P3 ： 5′-CAACT CGAGAACACCAGAGCACCCTAGAA-3′，P4：5′-ACGAAGCTTCCGATAAGGAGACCGTGAGA-3′ 以人胎肝6cDNA 为模板，PCR 扩增 hBKLFPCR 循环参数：94℃预变性 5分钟；94℃ 1 分钟； 58℃ 1 分钟；72℃ 1 分 30 秒，共 35 个循环；72℃延伸 7 分钟产物经 1％琼脂糖凝胶电泳分离，用 Wizard PCR 产物回收试剂盒回收，用 HindIII/XhoI 酶切后连入经 CIAP 去磷酸化处理的 pcDNA3.1/myc-his C 质粒 HindⅢ/XhoⅠ位点中连接产物转化 JM109 大肠杆菌，随机挑取 5-7 个克隆，酶切鉴定鉴定正确的克隆进一步测序鉴定细胞培养、转染及稳定株的筛选K562 细胞用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 于 37℃ 、 5% CO2 细胞培养箱中培养转染时，将 2×106/ml 对数期细胞接种于6 孔板中，每孔接种 0.8 ml；加入 3-4 μg 质粒与 20 μl lipofectamine 的混合物，7-8 小时后补充 4 ml 新鲜培养液，24-48 小时左右按 1∶5-10 分瓶，72 小时后加入 G418（终浓度 800 μg/ml）筛选，每 3 天换液 1 次，筛选 4 周，获得稳定细胞株。

用有限稀释法将多克隆细胞以 1 个细胞/ 孔接种于 96 孔板进行单克隆化COS- 7 细胞用含 10%小牛血清的 DMEM（高糖）于 37℃、5% CO2 细胞培养箱中培养转染时，将 2×105/孔对数期细胞接种于6 孔板中，培养过夜，至 70%-80%融合，每孔加入 2 μg 质粒与10 μl Lipofectamine 的混合物，继续培养 7-9 小时后换液，转染后 24-48 小时收获细胞7蛋白表达的 Western blot 测定细胞用冰预冷的 1×PBS 洗 2 遍，按每孔 500 μl 加入冰预冷的 RIPA(1×PBS，0.1% SDS, 0.5%脱氧胆酸钠，1% NP- 40)，冰上慢摇 20 分钟后，将细胞刮下，4℃，12 000×g 离心 10 分钟，保留上清蛋白样品经 SDS- PAGE 凝胶电泳分离后转膜，电流按（2×cm2 膜面积）mA，转膜 2-3 小时，于 TBSTM(5%脱脂奶，0.05%吐温 20)中 4℃封闭过夜，用 TBST(0.05%吐温 20)漂洗 10分钟，共 3 次，加辣根过氧化物酶标的抗 myc 抗体（1∶2 000-1∶5 000） ，室温慢摇 1 小时，TBST 漂洗。