烟草材质区的隔离和对转基因表述的结果.doc

中国过滤与分离公共技术服务平台 中国过滤与分离公共技术服务平台 烟草材质区的隔离和对转基因表述的结果烟草材质区的隔离和对转基因表述的结果含 pBGUS 菌株，引物 Pg1/Pg2 扩增出 13kb 片段即为阳性克隆含pBMGUSM1 的菌株，引物 Pg1/Pg2 扩增出 13kb 的 GUS 片段，Pt/P2 和 Pp/p1 的扩增条带约为 0.9kb 和 1kb，对照均未扩增出条带所有条带大小均与预期相符，表明表达载体已成功导入根癌农杆菌EHA105，而且再次确认 MARs 在载体上成同向排列转化及转基因植株的检测采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草叶外植体在筛选压 100mg/Lkan.的分化培养基上进行筛选培养，为确保得到的植株属于不同的转化体，每个外值体上只取一个不定芽继代，转移到相同培养基上进行再次筛选，获得的抗性苗转到含100mg/Lkan.的 MS 培养基上生根，待长到 34 片叶后移栽到营养钵中PCR 方法对这些植株进行鉴定，pBGUS 载体转化的植株采用GUS 基因的引物 Pg1/Pg2 进行扩增，得到约 13kb 的扩增片段；pBMGUSM1 转化植株用引物 Pp/P1 进行扩增，得到的片段约为1kb；试验所获抗性烟草植株均能扩增出预期条带。

GUS 活性定量测定取生长在室外充分展开的烟草叶片，稍加改进，对转基因烟草进行 GUS 活性定量检测，为减少误差，每株烟草的取材部位都是一致的，未转化植株取 10 株，不同载体转化的各取 25 株样品磨碎匀浆后离心，取 20L 上清液测定与底物 MUG 反应后的荧光值，剩余提取液保存用于蛋白含量测定，按 BRADRORD[6]的方法进行结果表明，pBMGUSM1 转化群体的表达水平普遍比中国过滤与分离公共技术服务平台 中国过滤与分离公共技术服务平台 不含 MAR 的 pBGUS 转化群体高，单株平均高 15 倍，非转基因烟草中则只测到本底活性，测定结果还表明，无论是否携带了MARs，GUS 表达活性在个体之间相差均很大，MAR 不能降低转基因植株间表达水平的差异讨论]基因工程是近 20 年来发展起来的在分子水平定向重组遗传物质，以改良植物性状或获得新产物的技术目前已在水稻、玉米、大豆、棉花、油菜、马铃薯、番茄、甘蓝等许多作物上获得了转基因植株，抗虫、抗病、抗除草剂、耐贮等的一些转基因作物已在生产上推广应用随着大量转基因植株的获得，人们发现了一些未曾预料到的现象，其中较普遍的一个现象是外源基因沉默（transgenes-ilencing）和外源基因表达量过低[7，8]，同一批转化所获得的不同转基因植株，其转基因表达在不同植株间存在明显差异，有些植株当代表达量较高，但其繁殖后代的表达量明显下降，甚至同一植株在生长过程中表达量也会慢慢降低或丧失。

转基因沉默或不稳定表达已成为进一步研究和应用植物转基因技术的主要障碍为了获得稳定表达的具有实际利用价值的转基因植株，许多科学家在克服转基因沉默方面进行了许多有益的尝试，如在构建表达载体时选用强启动子、使用增强子、在表达盒的两翼插入 MAR 分子和在转基因操作时进行去甲基化处理等大量研究表明，MAR 的引入是克服转基因沉默非常有效的一个途径，可以显著提高转基因的表达水平[1，2，9]本研究根据 MICHALOWS-KI[3]等报道的序列，分离了该 MAR 分子，经转化测定，含 MAR 的转基因植株，外源基中国过滤与分离公共技术服务平台 中国过滤与分离公共技术服务平台 因的表达水平普遍比不含 MAR 的转基因植株高，平均高 15 倍，这与大多数研究结果基本一致，即将 MAR 序列构建到外源基因的两侧后提高了转基因的稳定表达水平研究结果同时表明，MAR 的引入并不能消除个体间转基因表达的差异对于消除转基因表达的位置效应，不同研究结果差异很大，可见转基因调控是一个十分复杂的过程，可能与 MAR 片段的大小、碱基组成、结合能力、MAR 之间的距离等均有一定关系。